燈盞細(xì)辛注射液對大鼠腦缺血/再灌注后海馬區(qū)IGF—1表達(dá)的影響

[摘要] 目的 探討燈盞細(xì)辛注射液對大鼠腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。 方法 成年雄性Wistar大鼠24只，應(yīng)用線栓法經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動脈插線建立缺血2 h再灌注48 h模型，燈盞細(xì)辛注射液腹腔注射（3.6 mg/kg）干預(yù)治療，蘇木精-伊紅（HE）染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)，TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡，免疫組化染色法檢測IGF-1表達(dá)。 結(jié)果 經(jīng)燈盞細(xì)辛注射液干預(yù)后，胰島素樣生長因子-1（IGF-1）蛋白表達(dá)明顯升高，海馬神經(jīng)元顯著增加，細(xì)胞凋亡明顯減少，大鼠認(rèn)知功能明顯改善。 結(jié)論 燈盞細(xì)辛注射液可通過上調(diào)IGF-1的表達(dá)，有效地抑制細(xì)胞凋亡，改善學(xué)習(xí)記憶能力。

[關(guān)鍵詞] 腦缺血/再灌注；燈盞細(xì)辛注射液；IGF-1；神經(jīng)元凋亡；認(rèn)知功能障礙

[中圖分類號] R743 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）07-44-03

胰島素樣生長因子1（insulin like growth factor-1，IGF-1）在成熟腦組織廣泛低水平表達(dá)，對于神經(jīng)細(xì)胞的正常生長、發(fā)育以及受損細(xì)胞的恢復(fù)有重要作用[1-2]，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有治療作用[3-4]。許多研究發(fā)現(xiàn)[5-6]，腦缺血損傷后腦卒中IGF-1表達(dá)增強(qiáng)，IGF-1促進(jìn)軸突生長和神經(jīng)元存活。燈盞細(xì)辛注射液（Fleabane injection）的主要成分是燈盞花素，能改善大鼠腦缺血神經(jīng)功能損傷[7]，縮小腦梗死范圍[8]，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量[9]。本實驗試圖觀察燈盞細(xì)辛注射液對大鼠腦缺血/再灌注后神經(jīng)元凋亡和IGF-1表達(dá)的影響以及認(rèn)知功能障礙的作用。

1 材料與方法

1.1 大鼠腦缺血/再灌注模型

成年雄性Wistar大鼠24只，SPF級，4個月齡，體質(zhì)量230～250 g，由青島市藥物檢驗所實驗動物中心提供[（SCXK（魯）20090007）]。大鼠實驗前置實驗室環(huán)境適用1周，自由進(jìn)食、飲水，室溫（23±2）℃，自然光照，通風(fēng)，術(shù)前禁食12 h。隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=6），缺血/再灌注組（n=6），生理鹽水組（n=6）和藥物干預(yù)組（n=6）。應(yīng)用線栓法經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動脈插線建立缺血2 h再灌注48 h模型[10]，術(shù)后2 h出現(xiàn)左側(cè)Hoener征，提尾時右前肢內(nèi)收屈曲、爬行時向右側(cè)劃圈者為成功模型。術(shù)中和術(shù)后以恒溫電熱器保持動物肛溫36～37℃。假手術(shù)組除不插線外，其余步驟同實驗組。

1.2 治療方案

燈盞細(xì)辛注射液（云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司，Z53021569）。參照王羽等[9]報道的劑量，治療組給予燈盞細(xì)辛注射液腹腔注射3.6 mg/kg，假手術(shù)組和模型組同步注射等量生理鹽水。

1.3 評價指標(biāo)

1.3.1 學(xué)習(xí)記憶能力 治療后采用MAZE-I Y型電迷宮（江蘇省張家港市沙洲縣三興聲電公司），參照Zhang等[11]報道的測定方法進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶功能測試，統(tǒng)計大鼠學(xué)習(xí)記憶錯誤反應(yīng)頻率，以百分比（%）表示。

1.3.2 蘇木精-伊紅（HE）染色 治療結(jié)束后，以100 g/L水合氯醛0.3 mL（300 mg/kg）腹腔注射麻醉動物，依次用0.9%等滲生理鹽水250 mL、40 g/L多聚甲醛溶液250 mL經(jīng)心臟灌注固定，斷頭取腦，置40 g/L多聚甲醛溶液固定2 h，蒸餾水浸泡4 h。腦組織常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、經(jīng)石蠟包埋，連續(xù)冠狀位切片（CM2027，Leica，Germany），厚度7 μm，貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上，4℃保存?zhèn)溆谩Ｃ總€標(biāo)本取4張切片，常規(guī)脫臘水化，蘇木精染色5 min，75%鹽酸乙醇分化30 s，酸化伊紅復(fù)染1 min，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)。

1.3.3 TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡 取上述腦組織切片按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Stanta Cruz，美國）說明操作。顯微鏡（Olympus CK2，Olympus，日本）觀察，凋亡細(xì)胞核呈棕黃色染色為陽性，部分切片不加探針不出現(xiàn)陽性著色。每個標(biāo)本取4張連續(xù)切片，高倍鏡下（400倍）隨機(jī)選取海馬區(qū)不重疊的4個視野計數(shù)炎性細(xì)胞，以（）表示。

1.3.4 免疫組化染色法檢測IGF-1表達(dá) 兔抗大鼠IGF-1單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（S-P）免疫組化試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司），按試劑盒說明操作，DAB顯色，細(xì)胞漿出現(xiàn)黃染為IGF-1蛋白表達(dá)陽性，部分切片不加一抗不出現(xiàn)陽性著色。光鏡下（400倍）隨機(jī)取海馬區(qū)4個不重疊視野計數(shù)陽性細(xì)胞，以（）表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果采用SPSS15.0軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燈盞細(xì)辛注射液對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

腦缺血/再灌注大鼠（每組6例）測試學(xué)習(xí)記憶錯誤反應(yīng)率（4次，20.0%）較假手術(shù)組（1次，5.0%）和生理鹽水組（1次，5.0%）明顯增加（P<0.05）。藥物干預(yù)后大鼠迷宮測試學(xué)習(xí)記憶錯誤反應(yīng)率（2次，10.0%）明顯減少（P<0.05）。

2.2 燈盞細(xì)辛注射液對大鼠海馬病理改變的影響

HE染色顯示，假手術(shù)組海馬神經(jīng)元未見病理性改變，排列規(guī)整，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核染色質(zhì)著色均勻。缺血/再灌注48 h及生理鹽水對照組均發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，細(xì)胞排列紊亂，部分神經(jīng)元胞漿及核仁深染，變性細(xì)胞呈三角形或不規(guī)則形，胞核濃染，部分神經(jīng)元胞核丟失及胞漿缺失，呈空泡狀。藥物干預(yù)后海馬神經(jīng)元排列規(guī)整，變性細(xì)胞數(shù)量明顯較少，見圖1。

2.3 燈盞細(xì)辛注射液對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

假手術(shù)組可見海馬區(qū)海馬輪廓清楚，細(xì)胞排列整齊，有少量的凋亡神經(jīng)元（6.5±1.5個/視野）；缺血/再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡明顯增加（30.5±5.5個/視野），呈彌散性分布，部分細(xì)胞皺縮；生理鹽水組凋亡細(xì)胞減少（24.5±5.0個/視野），破碎細(xì)胞明顯增多；藥物干預(yù)后海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量（14.5±3.5個/視野）明顯減少（P<0.05），見圖2。

圖2 大鼠海馬CA2區(qū)凋亡神經(jīng)元，TUNEL染色×200

2.4 燈盞細(xì)辛注射液對大鼠海馬IGF-1表達(dá)的影響

假手術(shù)組海馬IGF-1陽性神經(jīng)元胞漿為廣泛表達(dá)（25.5±4.5個/視野），胞漿顆粒呈黃染，細(xì)胞排列規(guī)整；缺血/再灌注組海馬IGF-1陽性神經(jīng)元呈彌散性分布（7.5±2.0個/視野），可見較多細(xì)胞裂解物；生理鹽水組海馬IGF-1陽性神經(jīng)元分布紊亂，細(xì)胞數(shù)較少（8.5±2.0個/視野）；藥物干預(yù)組海馬IGF-1陽性神經(jīng)元數(shù)量（17.5±3.5個/視野）明顯增加（P<0.05），細(xì)胞排列較整齊，見圖3。

3 討論

腦缺血再灌注可導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能減退[12-13]。本研究結(jié)果顯示，腦缺血/再灌注組和生理鹽水對照組大鼠學(xué)習(xí)、

圖3 大鼠海馬CA3區(qū)IGF-1表達(dá)，SP染色×200

記憶能力出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能障礙，海馬神經(jīng)元變性明顯；而采用燈盞細(xì)辛注射液聯(lián)合干預(yù)治療對大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力有顯著的改善，海馬神經(jīng)元變性明顯減輕。海馬神經(jīng)元凋亡與認(rèn)知功能減退關(guān)系密切[14]。實驗結(jié)果顯示，燈盞細(xì)辛注射液能抑制腦缺血/再灌注后海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡，大鼠認(rèn)知功能明顯改善，學(xué)習(xí)、記憶能力顯著提高。IGF-1對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病（如創(chuàng)傷性腦損傷）具有的治療作用，可以減少神經(jīng)細(xì)胞死亡數(shù)量，改善損傷后的神經(jīng)行為功能[3-4]。另外，經(jīng)側(cè)腦室途徑注射IGF-1，可明顯減輕大鼠缺氧缺血性腦損傷模型的病理改變，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量[15]。本實驗結(jié)果顯示，燈盞細(xì)辛注射液可通過促進(jìn)海馬神經(jīng)元IGF-1蛋白表達(dá)，阻止海馬神經(jīng)元凋亡，改善腦神經(jīng)功能，與有關(guān)報道相一致[9]。綜上所述，黃芪注射液與燈盞細(xì)辛注射液聯(lián)合干預(yù)調(diào)控IGF-1蛋白的表達(dá)，是改善對大鼠腦神經(jīng)功能損傷的機(jī)制之一。

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（收稿日期：2013-02-26）