擬除蟲菊酯類農藥半抗原合成及酶聯免疫分析

胡久平，李相前，任世英，周禮紅

摘要：酶聯免疫分析（ELISA）是農藥殘留檢測的一種重要方法，具有方便快速、特異靈敏等優點。主要介紹了擬除蟲菊酯類農藥半抗原的合成方法，對擬除蟲菊酯分子的環丙烷、氰基和芳香環進行修飾；對擬除蟲菊酯水解產物進行修飾；增加一個連接臂作為半抗原。同時介紹了酶聯免疫分析的研究進展，對擬除蟲菊酯類農藥半抗原的合成及酶聯免疫分析進行了討論和展望。酶聯免疫分析在擬除蟲菊酯類農藥的殘留檢測中將起到越來越重要的作用。

關鍵詞：擬除蟲菊酯；半抗原；酶聯免疫分析（ELISA）

中圖分類號：S482.3；Q503 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）05-0993-04

Hapten Synthesis and ELISA Analysis of Pyrethroid Pesticides

HU Jiu-ping1，2，LI Xiang-qian1，3，REN Shi-ying1，3，ZHOU Li-hong2

（1.Huaiyin Institute of Technology， Huaian 223003，Jiangsu，China；2.College of Life Science， Guizhou University，Guiyang 550025，China；

3. Huaian High-Tech Research Institute， Nanjing University，Huaian 223003， Jiangsu， China）

Abstract： A enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） is an important method to detect the residue of pesticides with the characteristics of convenience and high efficiency. The main synthesis methods of hapten include modifying the cyclopropane， cyanogroup and aromatic nucleus of the pyrethroid insecticides， modifying the hydrolysate of the pyrethroid insecticides or adding a linker arm. Research progress in ELISA analysis was reviewed， and the methods of hapten synthesis and the application of ELISA were discussed. ELISA will be a promising method and play more and more important role in detecting the residue of pyrethroid insecticides.

Key words： pyrethroid； hapten； enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）

擬除蟲菊酯類農藥是一類重要的合成型殺蟲劑[1]，它具有高效、低毒、低殘留等特點，如今被廣泛用于農業、林業、公共衛生等方面。但隨著擬除蟲菊酯類農藥的大量使用，其殘留對環境和人類健康造成的危害，特別是在農產品和食品中的殘留問題不斷引起全社會的關注[2]。如今對于擬除蟲菊酯殘留的分析檢測多以高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜-電子捕獲法（GC-ECD）以及氣相色譜-質譜（GC-MS）等儀器分析的方法為主。雖然這些方法檢測靈敏度高，但樣品的前處理步驟多且檢測費用高，不適用于現場快速檢測。這些問題促使人們不得不尋找一種新的快速檢測方法。20世紀80年代以來，免疫學技術在農藥殘留檢測中的應用不斷深入，其中酶聯免疫分析（ELISA）技術是檢測農藥殘留較好的方法，它提供了一種對痕量殘留快速、靈敏、選擇性的檢測方法。酶聯免疫的關鍵技術是半抗原的設計、合成和抗體制備[3]。

1 半抗原的合成

擬除蟲菊酯類農藥多是相對分子質量小于1 000的化合物，其本身不具有誘導產生抗體的能力。且擬除蟲菊酯分子也往往不能直接與雙功能交聯劑或蛋白質共價偶聯，因此需要先通過化學反應在擬除蟲菊酯分子上引入活性基團由此合成半抗原再與蛋白質偶聯得到抗體[4]。目前半抗原的設計及合成主要有以下幾種途徑。

1.1 對擬除蟲菊酯上活性位點的修飾

1.1.1 對擬除蟲菊酯環丙烷的修飾 Lee等[5]和程敬麗等[6]將環丙烷上的雙鍵轉變為含羧基的酰胺制得半抗原（圖1）；祝金鳳[7]將環丙烷所連接的雙鍵通過高錳酸鉀氧化為羧基獲得半抗原；Mark等[8]用臭氧將連接在環丙烷上的雙鍵氧化為羧基和醛基；程敬麗等[9]用三氯化釕和高碘酸鈉也將環丙烷上連接的雙鍵氧化為羧基得到半抗原，且收率較高。

1.1.2 對活性基團氰基的轉化 王鳴華等[10]將溴氰菊酯中的氰基轉化為羧基和含羧基的酰胺達到制備半抗原的目的；張獻忠[11]用合成的方式制備溴氰菊酯并將其氰基轉化為羧基獲得半抗原；Lee等[5]將氰基轉化為羧基再與γ-氨基丁酸反應得到含羧基的酰胺半抗原（圖2）。

1.1.3 在擬除蟲菊酯芳香環上的修飾 擬除蟲菊酯的芳香環上也存在著進行修飾的理想位點。早在1998年Queffelec等[12]就在溴氰菊酯的芳香環上引入羰基酸來制備半抗原，其具有良好特異性，且與其他擬除蟲菊酯類沒有交叉反應。Lee等[13]用SnCl2將芳香環上的硝基還原為氨基，其衍生物作為半抗原所得抗體對溴氰菊酯檢測效果較好。羅世能等[14]在氯氟菊酯的芳香環上通過硝化、還原得到具有氨基活性基團的半抗原。孔曄等[15]將芳香環末端含硝基的溴氰菊酯的硝基還原后與丁二酸酐反應，得到芳香化末端含有羧基的酰胺半抗原（圖3）。

1.2 對擬除蟲菊酯菊酸部分的改造

擬除蟲菊酯作為一個酯類化合物，研究表明對其菊酸部分進行改造也可以得到半抗原。李培武等[16，17]直接通過酯交換反應將菊酸替換，并對酯交換后得到的產物進行修飾制得半抗原。此類半抗原制備出的抗體對擬除蟲菊酯類農藥具有較高識別特異性且其制備的擬除蟲菊酯類多克隆抗體效價非常高（圖4）；李瑩瑩等[18]用γ-氨基丁酸與酰氯化的PBA進行反應從而達到替換菊酸的目的，制得PBA-GABA半抗原并成功合成了擬除蟲菊酯的人工抗原（圖4）。王俊平等[19]用γ-氨基丁酸與PBA進行反應得到與李瑩瑩等[18]所制得的相同的半抗原，但其使用的方法和試劑相對更簡單。郝曉蕾[20]用酸酐取代菊酸部分得到含羧基的半抗原。

1.3 以擬除蟲菊酯水解后的酸和醇的衍生物為半抗原

擬除蟲菊酯水解后得到酸和醇，其衍生物也可以作為半抗原。早在1998年Anne-Laurence等[21]就對菊酸進行修飾得到了含γ-氨基丁酸的衍生物作為擬除蟲菊酯類農藥半抗原（圖5）。還有水解得到醇的衍生物，如1997年Anatoliy等[22]對水解得到的醇進行氧化得到酸作為半抗原。雖然制備這類半抗原較為簡單，但其制備的抗體特異性較差，多用于檢測農藥在哺乳動物體內的代謝產物。

2 酶聯免疫分析技術研究進展

酶聯免疫分析技術用于擬除蟲菊酯類農藥免疫分析已研究了多年且取得了一定的成果（表1）[4]。

根據擬除蟲菊酯類農藥殺蟲機理不同，此類農藥被劃分為兩類，即Ⅰ型和Ⅱ型擬除蟲菊酯類農藥。Ⅰ型擬除蟲菊酯類農藥不含氰基，相對應含有氰基的則為Ⅱ型，其結構式如圖6。

2.1 Ⅰ型擬除蟲菊酯的ELISA研究

2001年Takaho 等[23]利用氯菊酯衍生物和間苯氧基甲酸反應產物與甲狀腺球蛋白結合形成免疫原免疫兔子。經條件優化后，氯菊酯的IC50為30.0 μg/L，對苯醚菊酯的IC50為20.0 μg/L。

Ahn等[24]用ELISA檢測氯菊酯在人體內的殘留，以其代謝產物DCCA-glycine為檢測目標，結果反式DCCA-glycine的IC50為1.3～2.2 μg/L，順式DCCA-glycine的IC50為0.4～2.8 μg/L。

2.2 Ⅱ型擬除蟲菊酯的ELISA研究

Sally等[25]利用菊酸和間苯氧基芐醇反應制備半抗原后與甲狀腺球蛋白結合免疫原免疫動物制得多克隆抗體，并且進行條件優化，經優化的ELISA方法對各種擬除蟲類農藥的IC50氯氰菊酯為78 ng/mL，對百樹菊酯為205 ng/mL，對氨氟氰菊酯為120 ng/mL，對溴氰菊酯為13 ng/mL，對埃死菊酯為6 ng/mL，對氰戊菊酯為8 ng/mL，對氟胺氰菊酯為123 ng/mL。

Gao等[26]通過ELISA檢測功夫菊酯，其IC50為37.2 μg/L，最低檢測限為4.7 μg/L，與溴氰菊酯等的交叉反應弱。

3 討論與展望

半抗原的立體化學決定免疫分析的特異性[27]，因此在半抗原合成中需要保留原化合物的分子立體結構。在合成半抗原的時候一定長度和結構的連接臂可以增大半抗原的相對分子質量和空間構型，有利于刺激機體產生抗體。但并不是連接臂越長越大越好。Freia[28]認為連接臂以C3-6為宜，但也有研究者持不同的觀點。

在酶聯免疫分析中抗體結構和抗原結構相似的化學物質可被用來制備某一類有分子結構共性的通用抗體。國內外對擬除蟲菊酯類農藥的通用性抗體研究不多，國內僅南京農業大學的駱愛蘭等[29]和江蘇農業科學院的李志茹[30]以間苯氧基甲酸為半抗原制備了擬除蟲菊酯的通用抗體，但如何進行實際檢測應用還有待進一步研究。

擬除蟲菊酯類半抗原合成一直是酶聯免疫檢測的一個關鍵步驟，20世紀90年代以來小分子化合物免疫化學的理論和技術飛速發展，為人們從不同途徑設計合成半抗原提供了支持；在化學合成方面發現各種新型催化劑使合成中的目標產物產率不斷提高而副產物不斷減少；分離純化方面的技術也不斷提高；新的能有效得到半抗原的方法也將不斷出現，合成通用性半抗原也是可能的。酶聯免疫分析技術在農藥檢測上的應用在國內起步比較晚，但因其方便、快速、靈敏等優勢倍受人們的重視。酶聯免疫分析技術在農藥殘留和食品安全等諸多方面都具有廣闊的應用前景。

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