微小RNA-202和轉錄因子性別決定區Y框蛋白9在膀胱癌組織中表達與臨床病理特征及預后的關系

李路鵬，李曉光，劉棚越，劉敬濤，焦志靈，徐國良，王連渠

膀胱癌是臨床最常見泌尿生殖系統惡性腫瘤疾病之一，存在性別差異，男性發病率高于女性。全球范圍內，膀胱癌發病率位于惡性腫瘤第11位，死亡率位于第14位，在國內其發病率居惡性腫瘤第8位，居泌尿生殖系統惡性腫瘤第1位，并以每年3.9%增長率升高，且趨于年輕化，嚴重威脅病人生命健康。微小RNA（miRNA）在多種疾病中異常表達，參與疾病的發生、發展，微小RNA-202（miR-202）在多種惡性腫瘤疾病中低表達，而在膀胱癌組織中表達情況研究報道較少。轉錄因子性別決定區Y框蛋白9（Sox9）在胚胎期參與胃、腸、膽管等多種器官定向分化過程，進年來研究發現Sox9在多種惡性腫瘤中過表達，在腫瘤發生、發展中發揮重要作用。因此，本研究旨在探討miR-202和Sox9在膀胱癌中的表達及與臨床預后的關系，為膀胱癌預防、治療及預后評估提供參考資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年6月至2013年12月河南大學第一附屬醫院腫瘤科收治的120例行切除術的膀胱癌病人作為研究對象，其中膀胱全切除21例，膀胱部分切除術48例，經尿道膀胱腫瘤電切除51例，淋巴結轉移者行淋巴結清掃，術中分別收集病人癌組織（

n

=120）及癌旁正常組織（

n

=120）。納入標準：（1）經組織病理學確診為膀胱癌者；（2）治療前無手術、放化療史者；（3）病人對本研究知情，并簽署知情同意書；（4）本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。排除標準：（1）膀胱癌復發病人；（2）非本院手術者；（3）預測生存期＜3個月者；（4）原位癌者；（5）合并嚴重慢性病及實質器官功能障礙者；（6）血小板凝集障礙者；（7）自身免疫功能異常者；（8）合并其他器官惡性腫瘤者；（9）依從性差者。病人男82例，女38例；年齡范圍41～78歲，年齡（58.73±4.28）歲；病理類型：膀胱尿路上皮癌109例，膀胱腺癌7例，膀胱鱗狀細胞癌5例；腫瘤臨床分期采用國際抗癌聯盟（UICC）（2002）腫瘤-轉移-淋巴結分類（TNM）分期系統，其中肌層浸潤病人（Ta期27例，Tb期30例，Ta期17例，Tb期4例）78例，非肌層浸潤者（T期15例，T期27例）42例；病理分級按照WHO（2004年）分級標準：低級（G1+G2）54例，高級（G3）66例；影像學與病理學診斷為淋巴結轉移者21例，無淋巴結轉移者99例。

1.2 試劑與儀器

兔抗人Sox9抗體購自英國abcam公司，SP法蛋白提取試劑盒購自上?？党缮锕こ坦荆琓rizol購自Invitrogen公司，PrimeScriptRT reagent Kit、SYBR ?Premix Ex TaqⅡ購自大連Takara公司，Nanodrop 2000核酸檢測儀購自美國Themo公司，C1000Thermal CyclerPCR儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統均購自美國bio-rad公司，7500Fast Real-time PCR儀購自美國ABI公司，引物序列由上海生工公司合成。

1.3 方法

采用免疫組化（SP法）檢測病人組織中Sox9表達，以PBS作為陰性對照，待測組織4%多聚甲醛固定，包埋，切片，脫蠟、水化，抗原修復，操作步驟按照SP試劑盒說明書執行，Sox9染色定位于細胞核；采用熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測組織中miR-202、Sox9水平，首先根據試劑使用說明，取待測組織加液氮研磨成粉末狀，置于離心管中，加Trizol 1 mL，提取總RNA，核酸檢測儀檢測RNA濃度和純度，符合要求方可進行逆轉錄；cDNA合成：參照SYBR Green RCR master mix試劑（寶生物（大連）工程有限公司生產）說明加配熒光定量反應體系。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1。熒光定量反應體系加配完成后，放入Bio-Rad熒光定量PCR儀進行反應，反應結束后收集數據。miR-202以U6為內參基因，Sox9以β-actin為內參基因，采用2方法計算miR-202、Sox9相對表達量，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR擴增引物序列

2 結果

2.1 膀胱癌組織及癌旁組織中Sox9蛋白表達

膀胱癌組織中Sox9陽性表達率為70.83%（85/120），高于癌旁組織的31.67%（38/120）（

P

＜0.05），見圖1。

圖1 膀胱癌組織及癌旁組織中Sox9蛋白表達（SP×200）：A為膀胱癌組織中Sox9蛋白表達；B為癌旁組織中Sox9蛋白表達

2.2 膀胱癌組織及癌旁組織中miR-202和Sox9表達

膀胱癌組織中miR-202水平低于癌旁組織（

P

＜0.05），Sox9水平高于癌旁組織（

P

＜0.05），見表2。

表2 膀胱癌組織及癌旁組織中miR-202和Sox9表達比較

2.3 miR-202和Sox9表達與病人臨床病理參數關系

以膀胱癌病人組織中miR-202和Sox9表達中位數（0.63、7.92）為界值分為miR-202高表達組（

n

=68）和低表達組（

n

=52），Sox9高表達組（

n

=55）和低表達組（

n

=65）。miR-202、Sox9表達與年齡、性別、肌層浸潤無關（

P

＞0.05），與病理分級及淋巴結轉移相關（

P

＜0.05），見表3。

表3 膀胱癌120例miR-202和Sox9表達與臨床病理參數關系/例

2.4 膀胱癌組織中miR-202和Sox9表達相關性

Pearson相關性分析顯示，膀胱癌組織中miR-202和Sox9表達呈負相關性（

r

=-0.835，

P

＜0.001），見圖2。

圖2 膀胱癌120例癌組織中miR-202和Sox9表達相關性

2.5 miR-202、Sox9表達與膀胱癌病人預后關系

術后隨訪5年，膀胱癌組織中miR-202高表達病人中位生存時間為48.61個月，高于低表達組的37.99個月（

P

＜0.05），miR-202高表達病人預后5年生存率為52.94%，高于低表達的30.77%（

P

＜0.05），見圖3；Sox9高表達病人中位生存時間為（39.78±2.60）個月，低于低表達組的（49.62±1.90）個月（

P

＜0.05），Sox9高表達病人預后5年生存率為38.18%，低于低表達組的60.00%（

P

＜0.05），見圖4。

圖3 膀胱癌120例癌組織中miR-202高表達與低表達生存曲線分析

圖4 膀胱癌120例癌組織中Sox9高表達與低表達生存曲線分析

2.6 膀胱癌預后影響因素分析

先對病人年齡、性別、腫瘤數目、病理分級、TNM分期、淋巴結是否轉移、miR-202、Sox9表達進行COX單因素回歸分析，采用LR法進行回歸變量篩選，再對有統計學差異的變量進行COX多因素回歸分析，結果顯示，病理分級與膀胱癌病人預后無影響，TNM分期、淋巴結轉移、Sox9是影響病人預后的獨立危險因素，miR-202是影響膀胱癌病人預后的保護因素，見表4。

表4 膀胱癌120例影響預后的COX多因素回歸分析

3 討論

miRNA是一類高保守非編碼單鏈小RNA，廣泛存在于各種生物體中，發揮基因調控功能。近年來，越來越多研究發現miRNA在膀胱癌發生、發展中發揮重要作用。陳玉錦等研究發現miR-20a在膀胱癌組織中高表達，與腫瘤臨床分期、病理分級、轉移及復發相關，體外轉染其模擬物能提高腫瘤細胞增殖、侵襲及遷移能力。Ganji等發現miR-99a在膀胱癌組織中表達水平低于癌旁正常組織，并與肌層浸潤相關，檢測靈敏度為91%，特異性為97%，可作為膀胱癌診斷標記物。miR-202屬于miRNA，在多種腫瘤疾病中異常表達，於琳等發現miR-202在原發性肝癌組織及血清中均低表達，發揮抑癌基因作用，并與腫瘤數目相關，并能影響腫瘤細胞增殖，在原發性肝癌發生、發展中發揮重要作用。Zhang等研究發現miR-202在前列腺癌組織及細胞系中表達下調，其高表達可抑制腫瘤增殖、遷移及侵襲，并能通過調控其靶基因PIK3CA發揮腫瘤抑制劑作用。本研究結果顯示，膀胱癌組織中miR-202水平低于癌旁正常組織，與上述研究結果基本相似，提示miR-202在膀胱癌組織中低表達。通過與臨床病理參數關系研究顯示，miR-202表達與病理分級及淋巴結轉移相關，與Zhang等研究結果基本相似，提示miR-202參與膀胱癌發生、發展。研究中發現miR-202表達與臨床分期無關，可能于本研究樣本量少有關。

Sox是一類與胚胎發育密切相關的轉錄因子，Sox9是Sox家族重要成員之一，在多種腫瘤組織中高表達，尤其在惡性腫瘤中多發揮促癌基因作用。Link等研究發現Sox9在胃癌組織中過表達，與淋巴結轉移的囊外生長相關，Sox9高表達促進腫瘤發展，并與病人預后不良相關。Francis等研究發現Sox9在前列腺癌組織中高表達，與腫瘤細胞侵襲、轉移相關，體外細胞實驗發現Sox9可改變細胞骨架及細胞間粘附性，增強腫瘤細胞侵襲能力，為促進前列腺癌進展的驅動因素。本研究結果顯示，膀胱癌組織中Sox9陽性表達率為70.83%，高于癌旁組織的31.67%，膀胱癌組織中Sox9水平高于癌旁正常組織，并與病理分級及淋巴結轉移相關，這與萬頌等研究結果基本相似，提示Sox9在膀胱癌組織中高表達，并與疾病發生和發展密切相關。

Wainwright等研究發現在Sox9基因缺失小鼠模型中微小RNA-202-5p/3p（miR-202-5p/3p）在男性性腺中表達降低，miR-202前體為Sox9的下游靶基因，而Sox9與類固醇生成因子-1（SF1）結合位點突變可減少miR-202前體啟動子離體反式激活，進一步證明miR-202前體是Sox9在睪丸分化期的直接轉錄靶點。

本研究通過相關性分析顯示，膀胱癌組織中miR-202和Sox9表達呈負相關，與上述研究結果具有相似性，提示miR-202和Sox9可能通過負向調控參與膀胱癌發生、發展，其具體機制還需進一步研究。通過miR-202和Sox9對膀胱癌病人預后相關分析顯示，膀胱癌組織中miR-202高表達病人中位生存時間高于低表達組，miR-202高表達病人預后5年生存率為52.94%，高于低表達的30.77%；Sox9高表達病人中位生存時間低于低表達組，Sox9高表達病人預后5年生存率為38.18%，低于低表達的60.00%，與Wan等研究結果基本相似，提示miR-202低表達、Sox9高表達膀胱癌病人生存時間短，預后較差，有可能成為其預后評估的潛在生物標記物。最后通過預后影響因素分析顯示，TNM分期、淋巴結轉移、Sox9是影響病人預后的獨立危險因素，miR-202是影響膀胱癌病人預后的保護因素，進一步提示miR-202、Sox9表達與膀胱癌預后相關。

綜上所述，膀胱癌組織中miR-202低表達，Sox9過表達，二者表達呈正相關，與病人病理分級及淋巴結轉移相關，miR-202低表達與Sox9高表達病人生存期短，預后較差，可作為病人預后評估的檢測指標。由于本研究樣本量有限，且為單中心選樣，可能會造成一定結果誤差，在后期研究中盡可能擴展樣本量，開展多中心研究，減少誤差，提高研究的準確性。