T—RFLP分析不同森林類型土壤真菌組成及分布

武耀祥等

摘要：在長白山森林生態系統定位站，利用T-RFLP技術研究了6種不同森林類型土壤真菌組成及其分布特征。結果表明，6種不同森林類型土壤真菌多樣性指數以白樺林中后期最高，過熟闊葉紅松林次之，楊樺成熟林最低。不同森林類型的真菌群落相似度也很低，其數量、類型及分布均存在著差異。

關鍵詞：土壤；真菌；DNA提取；ITS-PCR；T-RFLP

中圖分類號：Q938.1+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）06-1443-04

土壤微生物是森林生態系統中最重要的組分，在凋落物分解、腐殖質合成以及養分循環等過程中起著十分重要的作用。其種類和組成不僅直接影響土壤的生物化學循環，而且是土壤生物活性的具體體現，并在森林生態系統的物質循環和能量流動中扮演著重要角色[1-3]。不同土壤分布著不同的土壤微生物，而不同的微生物多樣性又影響土壤功能的多樣性[4]。土壤微生物的組成和分布可以在深層次上揭示森林生態系統的物質循環和能量流動。目前測定土壤微生物多樣性的方法主要有稀釋平板法、磷脂脂肪酸分析（PFLA）法、Biolog微平板分析法及分子生物學方法等[5]。隨著分子生物學技術在土壤微生物研究中的不斷發展，土壤微生物多樣性的研究有了新的突破。核糖體ITS區為非編碼區，受到的選擇壓力較小，進化速度快。因此該區段能夠提供比較豐富的變異位點和信息位點，目前已經用于種間、亞種和種群水平上的遺傳多樣性研究[6]。自從Innis等[7]1990年首先設計ITS引物對真菌核內核糖體RNA基因進行擴增以來，ITS序列分析技術在真菌分類、鑒定的研究中應用越來越廣泛。

該研究利用分子生物學技術對長白山自然保護區不同森林類型的土壤真菌群落組成進行分析，比較不同植被類型與土壤真菌之間的關系及變化趨勢，以期加深對土壤真菌變化過程和機制的認識，為長白山區域天然林保護和生態建設提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品于2010年10月采自長白山自然保護區（表1）。按不同林型采用對角線型混合取樣法采集表層的土壤，采集深度為0～5 cm，用塑料袋封裝帶回。-80 ℃下密封保存。

1.2 試劑與儀器

Taq DNA 聚合酶、dNTPs、限制性內切酶Hinf Ⅰ購自寶生物工程（大連）有限公司；土壤真菌基因組提取試劑盒購自MoBio Laboratories公司；DNA純化試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。Gene-9700型PCR擴增儀、上海盧湘儀臺式離心機、BIO-RAD凝膠成像系統等。

1.3 方法

1.3.1 土壤樣品DNA的提取與檢測 土壤樣品DNA的提取參照MoBio土壤真菌提取試劑盒的方法。

1.3.2 ITS-PCR擴增及產物純化 用于ITS片段擴增的引物采用真菌ITS區通用引物ITS1-F和ITS4，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，具體序列如下：ITS1-F（5′→3′）：CTTGGTCATTTAGAGG

AAGTAA；ITS4（5′→3′）：TCCTCCGCTTATTGATAGC。

ITS擴增反應體系為：5 μL 10×PCR Buffer（50 mmol/L KCl；10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3；1.5 mmol/L MgCl2）、2 μL DNA模板、ITS1-F和ITS4（10 μmol/L）各2.5 μL、4 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），加ddH2O至50 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性60 s，52 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環；最后72 ℃延伸8 min。取5 μL ITS-PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像處理系統觀察拍照。

1.3.3 ITS-PCR產物的純化 采用DNA純化試劑盒，按照說明書進行PCR產物純化。

1.3.4 ITS-PCR產物的限制性酶切分析 ITS-PCR產物的T-RFLP分析反應體系為30 μL：含10 μL ITS-PCR產物、2 μL Hinf I（10 U/μL）、3 μL 10× Buffer、加ddH2O至30 μL。置于37 ℃水浴中酶切反應4 h，然后65 ℃作用20 min終止反應。將酶切產物送至上海美吉生物醫藥有限公司測序。

1.3.5 數據分析 每個T-RFLP的豐度百分比（Ap，%）按照公式Ap=ni/N×100%計算， 其中ni代表每個可分辨的T-RFLP的峰面積， N代表所有T-RFLP峰面積的總和。種群多樣性指數[8]用BIO-DAP軟件計算。依據公式Cs=2N（A+B）/（NA+NB）計算樣品之間Sorenson[9，10]的相似系數， 其中NA+B指兩樣品共有的條帶數目，NA、NB指兩樣品各自包含的條帶數目。

2 結果與分析

2.1 不同森林類型土壤真菌T-RFLP分析結果

利用限制性內切酶Hinf Ⅰ對6種不同森林類型土壤真菌ITS區進行酶切，T-RFLP分析結果見圖1。從圖1可以看出，酶切譜帶清晰，RFLPs比較明顯，酶切片段在100～600 bp之間，不同森林類型真菌群落存在明顯差異。

2.2 不同森林類型土壤真菌多樣性

不同森林類型土壤真菌香農多樣性指數、均勻度見表2。由表2可知，1號樣點的香農多樣性指數最高，3號樣點的最低；1、2、3、5號樣點的均勻度高，4號樣點的均勻度最低。一般而言，多樣性越高群落穩定性大，穩定性的大小反映了多樣性的大小。植物根系可為微生物棲息提供很好的場所，植被覆蓋使得土壤濕度更適合于群落的發展，微生物群落的發展反過來又有利于植物群落的發展。

2.3 不同森林類型土壤真菌相似性

從不同森林類型土壤真菌群落結構相似性系數分析結果見表3。由于森林類型的不同，土壤的真菌群落也有較大差異，群落功能也有較大差異，甚至森林類型接近的土壤，真菌的相似性也比較低，森林土壤真菌的空間差異性很大。

3 小結與討論

3.1 土壤樣品DNA的提取與純化

如何獲得高質量的土壤樣品總DNA是分子生物學技術的基礎和關鍵[11]，只有獲得高質量的土壤樣品總DNA才能保證后續PCR擴增的準確、可靠。土樣中主要污染物為多糖、腐殖酸和酚類化合物，其中腐殖酸的理化性質與核酸相似，因此在DNA提取過程中很難完全去除，而腐殖酸等雜質會影響后續的PCR反應[12]。

3.2 土壤真菌多樣性指數

香農多樣性指數是一種評價不同土壤的微生物群落多樣性十分有效的方法，香農多樣性指數越高表明微生物群落多樣性越大，它由種類的豐富度及種類的均勻度兩部分組成[13，14]。在不同類型的森林土壤中，真菌的群落香農多樣性指數呈現出較大的差異性和復雜性，這可能是由于天然森林中的真菌的空間異質性高所致。白樺林中后期和過熟闊葉紅松林，光照充足， 干擾少， 土壤結構比較穩定， 枯枝落葉積累多， 水分涵養好， 適合微生物生長， 所以土壤真菌的類群多，土壤相對較肥沃。從整體上來看， 白樺林中后期和闊葉紅松林土壤質量高， 微生物種類多，土壤結構穩定，有利于植物的生長。

該研究對不同森林類型土壤真菌群落的變化規律進行研究， 探討了真菌群落的演替規律， 但對于真菌群落的變化規律以及微生物與植物之間如何互作還需進一步研究。同時對于其他樣點的森林類型土壤微生物群落的變化規律如何還有待進一步揭示。

參考文獻：

[1] 王銳萍，劉 強，彭少麟，等.尖峰嶺不同樹種枯落物分解過程中微生物動態[J].浙江林學院學報，2006，23（3）：255-258.

[2] 李延茂，胡江春，汪思龍，等.森林生態系統中土壤微生物的作用與應用[J].應用生態學報，2004，15（10）：1943-1946.

[3] 趙 萌，方 晰，田大倫.第2代杉木人工林地土壤微生物數量與土壤因子的關系[J].林業科學，2007，43（6）：7-12.

[4] 臧 蕾，張宗舟，藺海明.白水江自然保護區土壤霉菌數量及物種多樣性分析[J].甘肅農業大學學報，2006，41（5）：100-104.

[5] 婁 鑫，崔曉陽.溫帶森林次生演替過程中土壤微生物多樣性研究[J].土壤通報，2011，42（3）：557-561.

[6] 戴 偉，郭永軍，王曉梅，等. 3個地理居群泥蚶核糖體DNA ITS區的RFLP分析[J].安徽農業科學，2010，38（10）：4990-4991.

[7] INNIS M A， GELFAND D H， SNINSKY J J，et al. PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications[M]. New York： Academic Press，1990.315-322.

[8] 姚 斌，錢曉剛，于成志，等.土壤微生物多樣性的表征方法[J].貴州農業科學，2005，33（3）：91-92.

[9] HORSWELL J， CORDINER S J， MAAS E W， et al. Forensic comparison of soils by bacterial community DNA profiling[J]. Journal of Forensic Science，2002，47（2）：350-353.

[10] 葛蕓英，陳 松，孫 輝，等.土壤細菌群體多樣性的T-RFLP分析應用探討[J].中國法醫學雜志，2008，23（2）：104-106.

[11] RICHARD A H， QIU X Y， WU L Y，et al. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments[J]. Applied and Environmental Microbiology，2001，67（10）：4495-4503.

[12] TIMOTHY M S， IAN L P， CHARLES P G. Removal of PCR inhibiting substances in sewage sludge amended soil[J]. Water Science and Technology，1995，31（5）：311-315.

[13] HARCH， B D， CORRELL R L， MEECH W， et al. Using the Gini coefficient with BIOLOG substrate utilization data to provide an alternative quantitative measure for comparing bacterial soil communities[J]. Journal of Microbiological Methods，1997，30（1）：91-101.

[14] STADDON E J， DUCHESNE L C， TREVORS J T. Microbial diversity and community structure of post disturbance forest soils as determined by sole-carbon source utilization patterns [J]. Microbial Ecology，1997，34（2）：125-130.