瑞香狼毒總黃酮超臨界CO₂萃取工藝的優化

羅喜榮等

摘要：探討超臨界CO2萃取瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）中總黃酮的優化工藝條件，采用響應曲面法考察萃取壓力、萃取溫度、乙醇用量對總黃酮收率的影響。結果表明，優化的萃取條件為萃取壓力27 MPa、萃取溫度52 ℃、乙醇用量3 mL/g，此條件下總黃酮收率為1.412%。

關鍵詞：瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）；總黃酮；超臨界CO2萃??；響應曲面法

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）06-1404-02

瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）是瑞香科狼毒屬植物，其藥用部位為根，在中國西北、西南、東北等地區廣為分布，資源極其豐富?，F代藥理研究及臨床應用表明，瑞香狼毒具有抑制腫瘤細胞增殖、阻止細胞分裂、誘導細胞凋亡等作用，其抗腫瘤作用效果顯著[1]。瑞香狼毒具有結構較特殊的雙二氫黃酮類、香豆素類、木脂素類等化合物，有利于抗腫瘤活性物質的篩選，是理想的天然藥物開發品種。有研究表明瑞香狼毒的總黃酮提取物急性毒性較小，對體外培養的腫瘤細胞有較強的抑制作用，其作用強于長春新堿，對小鼠移植性腫瘤抑制率與環磷酰胺接近，能明顯抑制肝癌細胞的增殖，其作用呈現明顯的劑量-時間依賴性，具有很大的潛在藥用價值[2，3]。

目前瑞香狼毒總黃酮的提取方法主要有回流提取法、索氏提取法、超聲波輔助提取法等[4，5]，這些方法耗時較長、溶劑用量大。超臨界CO2萃取技術具有步驟簡單、選擇分離效果好、提取率高、不破壞活性物質的結構和性質等優點，本研究采用Box-Behnken響應曲面法對超臨界CO2萃取瑞香狼毒中總黃酮工藝進行優化，尋找最佳工藝條件，為瑞香狼毒總黃酮的開發利用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：瑞香狼毒由甘肅省蘭州市生產，將其粉碎成1 mm顆粒備用。試劑：蘆丁標準品購自中國藥品生物制品檢定所，所用化學試劑均為分析純。儀器：4 L超臨界萃取裝置為自行研制，F-2500型熒光分光光度計購自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮的提取 采用Box-Behnken響應曲面設計法，以萃取壓力、萃取溫度、乙醇用量為自變量，以總黃酮收率（y）為響應指標設計三因素三水平試驗方案，試驗因素與水平見表1。取瑞香狼毒粉200 g置于超臨界萃取器，設定萃取時間為1 h、CO2流量為20 L/h、解析壓力為5 MPa、解析溫度為60 ℃。當達到預定溫壓條件，啟動夾帶劑泵，定量打入95%乙醇，萃取過程中從解析器收集萃取液。

1.2.2 總黃酮收率的測定 精密稱取10 mg蘆丁，用甲醇溶解、定容至10 mL，配制成1 mg/mL的標準儲備液；分別取蘆丁標準儲備液5、10、15、20、25 μL置于5 mL比色管中，加入0.6 mL 0.1 g/L AlCl3-甲醇溶液，用甲醇定容至刻度，配制成系列標準工作溶液。在激發及發射通帶均為10 nm、激發波長為435 nm、發射波長為490 nm條件下測定蘆丁標準工作溶液的熒光強度，以熒光強度相對應的濃度繪制工作曲線，得線性回歸方程為■=39.74x+10.41，其中，y為熒光強度，x為蘆丁濃度（μg/mL），相關系數r=0.998 4。取一定體積的樣品液揮干用同法測定，根據工作曲線計算總黃酮濃度及收率（y）。y=總黃酮質量（g）/原料質量（g）×100%。

2 結果與分析

2.1 試驗結果與模型方程的建立

總黃酮的超臨界CO2提取響應曲面試驗設計方案與結果見表2。利用Minitab 16軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合，得響應曲面二次多元回歸模型：■=-3.137 46+0.069 73x1+0.105 27x2+0.393 60x3-0.001 40x12-0.001 06x22-0.047 29x32+0.000 13x1x2+0.000 09x1x3+0.001 02x2x3，對該模型進行方差分析，結果見表3，回歸模型系數顯著性檢驗結果見表4。由表3可知，模型P=0.001<0.01，表明該模型極顯著，失擬項P=0.062>0.05不顯著，R2=0.983 2說明該模型擬合程度較好，試驗誤差小，可以用此模型對總黃酮的超臨界CO2提取進行分析和預測。由表4可知模型中一次項x1、x2及二次項x12顯著，二次項x22極顯著，其他項均不顯著。

2.2 響應曲面分析與優化

根據回歸模型作出響應曲面圖，見圖1至圖3。運用軟件響應優化器望大尋優得到總黃酮最佳提取工藝條件為萃取壓力27.58 MPa、萃取溫度52.73 ℃、乙醇用量3 mL/g。為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優化提取條件進行總黃酮的超臨界CO2提取，為方便實際操作將提取工藝參數修正為萃取壓力27 MPa、萃取溫度52 ℃、乙醇用量3 mL/g，此條件下總黃酮理論收率為1.437%，經驗證試驗得到總黃酮收率為1.412%，與理論預測值非常接近，表明基于響應曲面法獲得的優化提取工藝參數準確可靠，具有實用價值。

3 結論

通過響應曲面法建立了瑞香狼毒總黃酮收率與萃取壓力、萃取溫度、乙醇用量關系的回歸模型，經檢驗證明該模型準確有效，超臨界CO2萃取瑞香狼毒總黃酮優化工藝條件為萃取壓力27 MPa、萃取溫度52 ℃、乙醇用量3 mL/g，此條件下總黃酮收率為1.412%。

近年來研究發現，瑞香狼毒具有抗驚厥、抗癲癇、抗腫瘤、抗菌、抗結核、抗病毒、抗氧化、改善機體免疫功能等多種藥理作用，不良反應相對較小、較少，是一種有價值的宜于深入研究的中藥。

參考文獻：

[1] 梁秀艷，吳琳華. 中藥瑞香狼毒抗腫瘤作用研究概況[J]. 中國中醫藥科技，2008，15（1）：80-81.

[2] 王 敏，賈正平，馬 駿，等. 瑞香狼毒總黃酮提取物的抗腫瘤作用[J].中國中藥雜志，2005，30（8）：603-606.

[3] 吳曉亮，韓 敏，劉曉松，等. 不同瑞香狼毒提取物對肝癌細胞的抑制作用[J]. 畜牧與飼料科學，2009，30（9）：5-6.

[4] 吳曉亮，韓 敏，劉曉松，等. 瑞香狼毒總黃酮3種提取方法的比較[J]. 畜牧與飼料科學，2009，30（1）：39-40.

[5] 張如剛，劉曉松，哈斯蘇榮，等. 不同提取方法對瑞香狼毒總黃酮含量的影響[J]. 黑龍江畜牧獸醫（科技版），2010（1）：129-131.