高效能培養(yǎng)單胞藻方法研究

滕瑜等

摘要：利用高效能封閉裝置對單胞藻進(jìn)行半連續(xù)培養(yǎng)，提高了單胞藻生產(chǎn)的穩(wěn)定性，適合大規(guī)模生產(chǎn)性培養(yǎng)，可解決四角蛤凈化保活期間單胞藻的持續(xù)供給問題，為實際生產(chǎn)應(yīng)用提供可靠的保證。

關(guān)鍵詞：單胞藻；四角蛤；培養(yǎng)；凈化

中圖分類號：S968.4文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2013）07-0035-03

四角蛤是黃渤海南部的重要經(jīng)濟(jì)貝類之一^[1]，生棲在近海灘涂，含有泥沙和微生物，需要進(jìn)行凈化吐沙，否則會使產(chǎn)品牙磣而影響商業(yè)價值^[2]。單胞藻具有營養(yǎng)豐富、生長繁殖迅速、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的特點，是水中溶氧的重要來源，也是貝類等的重要餌料^[3]。但單胞藻培養(yǎng)經(jīng)常受到諸如氣候、設(shè)備、操作方法等條件的制約^[4]，為解決此問題，國內(nèi)外開發(fā)出保存藻泥^[5]、濃縮藻膏^[6]等產(chǎn)品。高效能單胞藻培養(yǎng)裝置采用半連續(xù)培養(yǎng)的方法生產(chǎn)單胞藻，可用于凈化保活四角蛤等貝類，同時控制海水pH值、鹽度等，其主要特點是占地面積小、培養(yǎng)容量大、生產(chǎn)周期短、抗污染能力強(qiáng)，適合我國單胞藻的大規(guī)模生產(chǎn)性培養(yǎng)，可解決四角蛤凈化保活期間單胞藻的持續(xù)供給問題。

1培養(yǎng)裝置及方法

1.1單胞藻培養(yǎng)裝置

全套裝置由兩個直立矩形生物餌料器架和夾中間的光溫控制架組成。生物餌料器架包括架體和塑料薄膜袋兩部分，架體是由普通2.5 cm角鋼按一定的設(shè)計要求焊制，規(guī)格為210 cm×155 cm×55 cm，主要作用是支撐薄膜袋，使之保持直立并承受水的壓力；塑料薄膜是由有效容積1.5 m3、厚度為0.10～0.12 mm的復(fù)合薄膜熱合而成。光溫控制架中的人工輔助光源由12支40 W日光燈組成，最大光照強(qiáng)度為8 200 lx，薄膜袋內(nèi)的加熱保溫元件采用聚四氟乙烯電加熱線，功率為2 000 W、1 000 W和500 W，藻液溫度由薄膜袋內(nèi)的8002型溫度自控儀控制。

1.2培養(yǎng)室

單胞藻小規(guī)模培養(yǎng)時不需另建培養(yǎng)室，可利用現(xiàn)有實驗室、培養(yǎng)室、育苗室，生物餌料容量框架可單獨安放在室內(nèi)池沿，利用自然光照進(jìn)行培養(yǎng)，必要時可與光溫控制架組合在一起，在實驗室、培養(yǎng)室利用控溫裝置和人工輔助光源提高培養(yǎng)效果。大規(guī)模培養(yǎng)單胞藻時可建造專用培養(yǎng)室，培養(yǎng)室以南北走向為宜，屋頂為白色玻璃鋼瓦，四周裝有大玻璃窗，晴天采光一般要求10 000 lx以上，室內(nèi)裝有暖氣、輔助光源，還可以配備海水消毒池、洗袋池和充氣設(shè)備等。

1.3供水供氣系統(tǒng)

復(fù)合薄膜袋培養(yǎng)單胞藻用的海水需先經(jīng)沉淀、沙濾后進(jìn)入水處理池，再用0.025%次氯酸鈉溶液 （含有效氯10%）進(jìn)行消毒，靜置12 h后加入硫代硫酸鈉溶液充氣中和余氯，經(jīng)檢查無余氯后供給培養(yǎng)使用。如果培養(yǎng)用水需要升溫，可在消毒的同時提溫。藻種及擴(kuò)種培養(yǎng)用海水經(jīng)四層200目篩絹加一層脫脂棉過濾，煮沸后方可使用。復(fù)合薄膜袋培養(yǎng)單胞藻需要晝夜充氣，每個袋內(nèi)需設(shè)置2～4個100#氣石，氣源可利用育苗室（或餌料室）原有氣源，也可利用自帶的小型充氣機(jī)，充氣量為單胞藻培養(yǎng)水體的2%左右。

1.4余氯的簡易檢測方法

次氯酸鈉消毒遺留在海水中的氯量稱余氯，余氯主要以HOCl和OCl-的形式存在，加入碘化鉀后作用釋放碘，能使淀粉溶液變藍(lán)。稱取固體淀粉10 g，加入少量純水研磨成糊狀，然后加入1 000 ml沸水，為防腐敗可加4 g ZnCl2或1.25 g水楊酸，攪勻冷卻后取上清液；配制0.2 mol/L的KI：稱取固體33.6 g KI于燒瓶中，加純水至1 000 ml處，待完全溶解后使用。取適量水樣加幾滴淀粉溶液，再往里加幾滴KI溶液，溶液變成藍(lán)色則表示有余氯存在。

2工藝流程

2.1藻種培養(yǎng)

藻種培養(yǎng)要在保種室內(nèi)進(jìn)行，室內(nèi)要設(shè)置培養(yǎng)架，架上有日光燈做輔助電源，用開關(guān)控制光照強(qiáng)弱。培養(yǎng)容器為3 000～5 000 ml的三角燒瓶，接種前要用淡水煮沸法或烘箱干燥法消毒。

2.2擴(kuò)種培養(yǎng)

擴(kuò)種培養(yǎng)是在10 000 ml的細(xì)口瓶中進(jìn)行，細(xì)口瓶的消毒方法如下：用淡水加去污粉洗凈→濃鹽酸浸泡→消毒水反復(fù)清洗。擴(kuò)種數(shù)量根據(jù)袋培養(yǎng)需要安排，應(yīng)保證向薄膜袋提供各種高純度的藻種。

2.3復(fù)合薄膜袋培養(yǎng)

2.3.1準(zhǔn)備工作先把薄膜袋裝在框架內(nèi)，調(diào)整好，接通袋內(nèi)外的收獲藻液管、取樣檢測管、充氣管和氣石（氣石上要栓重物使氣石能沉在水底）。如需加熱保溫，再把電加熱線從袋子的小口引入。所有裝入袋內(nèi)的物品，均要先經(jīng)0.0025%高錳酸鉀消毒，淡水沖洗干凈。做好以上工作后，蓋緊薄膜袋的兩個管口蓋子，然后向袋內(nèi)充氣，使薄膜袋膨脹成型，緊貼在框架上。

2.3.2加水和營養(yǎng)鹽所有工作做妥后往袋內(nèi)注入消毒海水，然后按水量加營養(yǎng)鹽。新月菱形藻和等鞭金藻營養(yǎng)鹽配方見表1。

2.3.3接藻種接種的藻種要逐一鏡檢，有原生動物的藻種一定不要接進(jìn)薄膜袋內(nèi)。接種時間最好在晴天上午8～10時，要選擇生活力強(qiáng)、生長旺盛、藻液顏色正常的藻種，藻種濃度一般在220～250萬/ml，新月菱形藻在300萬/ml左右。接種時把瓶內(nèi)藻液直接倒入薄膜袋內(nèi)。等鞭金藻和新月菱形藻接種濃度見表2。

2.3.4日常管理要經(jīng)常檢查薄膜袋內(nèi)的充氣情況，使袋內(nèi)藻液能翻騰為宜。隨時觀察藻類生長情況，正常生長的藻液，袋內(nèi)無沉淀、結(jié)團(tuán)和附壁現(xiàn)象，并且隨培養(yǎng)天數(shù)的增加，藻液顏色逐日加深；經(jīng)常取樣鏡檢藻細(xì)胞濃度，掌握藻類生長繁殖情況；每天定時測光照、溫度和pH值，藻液濃度加大時要相應(yīng)增加充氣量，視藻類生長情況每天或隔天加營養(yǎng)鹽。

2.3.5收獲和再培養(yǎng)復(fù)合薄膜袋培養(yǎng)單胞藻，由于接種濃度不同，接種后經(jīng)2～4 d培養(yǎng)即可首次收獲，收獲的濃度和收獲量見表2。收獲的方法有兩種：一種是虹吸法，利用裝置上的自動收獲系統(tǒng)，把藻液從收獲管中虹吸出來；另一種方法是使用自吸泵抽取藻液，自吸泵的取液管直接連在薄膜袋的收獲管口上，將藻液泵到遠(yuǎn)處及位置較高的育苗池中。收獲后的薄膜袋內(nèi)要立即注入消毒海水，并按注水量添加營養(yǎng)鹽繼續(xù)培養(yǎng)，一般隔1～2 d又可重新收獲，如此循環(huán)，每個薄膜袋可收獲5次以上。收獲的藻液可為其它薄膜袋接種用，這樣能大幅地減少接種和擴(kuò)種規(guī)模，對于單胞藻的大規(guī)模生產(chǎn)很有益處。首次收獲的藻液新鮮、生長旺盛、純度高，用于接種的稀釋濃度較小，隨著收獲次數(shù)增多，稀釋濃度不斷增大，培養(yǎng)周期不斷縮短。經(jīng)多次收獲后藻類生長逐漸緩慢，老化細(xì)胞、雜質(zhì)增多，在薄膜袋底部出現(xiàn)附壁現(xiàn)象，即使稀釋濃度超過200萬/ml，也達(dá)不到預(yù)期培養(yǎng)效果，且很容易出現(xiàn)死亡，失去了培養(yǎng)的意義，此時即可全部收獲。其收獲后的稀釋濃度與培養(yǎng)周期的關(guān)系見表3。

2.3.6薄膜袋的再利用全部收獲后的復(fù)合薄膜袋還可再次使用。先把薄膜袋放入加洗衣粉的水中搓洗，再放入0.025%次氯酸鈉中浸泡12 h，淡水洗凈再用。最好放入100℃的沸水中浸泡進(jìn)行高溫消毒。一般一個袋可重復(fù)使用2～3次。

2.3.7注意事項①薄膜袋使用前要仔細(xì)檢查有無漏洞，特別是接縫壓合處，如果有漏洞，用聚乙烯薄膜膠粘牢再用。②防污染是關(guān)鍵，操作前所有工具和手均要經(jīng)過徹底消毒。③隨著藻細(xì)胞的生長繁殖，藻液顏色不斷加深，要逐漸增加充氣量。④接種、收獲和添加營養(yǎng)鹽的工作一般要在每天上午進(jìn)行。

3討論

利用高效能封閉式單胞藻培養(yǎng)裝置對四角蛤進(jìn)行凈化吐沙，能為四角蛤提供一個相對穩(wěn)定的吐沙環(huán)境，12～24 h達(dá)到無泥沙要求，既保證了四角蛤的攝食要求，又保證了充分的氧氣供應(yīng)，提高了凈化質(zhì)量，增強(qiáng)了生產(chǎn)的穩(wěn)定性，節(jié)省了水體、能源和勞力，又通過從源頭、養(yǎng)殖、加工到餐桌控制質(zhì)量，進(jìn)行可追溯管理，進(jìn)一步保證了產(chǎn)品的安全性^[7]。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行四角蛤等貝類的凈化加工、低溫保活流通及產(chǎn)業(yè)化示范，不僅提高產(chǎn)品的附加值，還可促進(jìn)我國海洋經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)健康發(fā)展^[8]。

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