以甘油為碳源生產細菌纖維素條件優化

馬春華，辜文彥，王依靜

（武夷學院 茶與食品學院，福建 武夷山 354300）

細菌纖維素（bacterial cellulose，簡稱BC）是由各種類型的細菌合成的，在材料、造紙、醫藥及食品領域都有廣泛的應用[1-3]。與天然纖維素相比，細菌纖維素具有高持水性、高機械強度、良好生物相容性等獨特性能[4],但其發酵工藝落后、產量低、生產成本高一直是限制其應用于高附加值產品生產的瓶頸[5]。在細菌纖維素的研究上，多集中在原料的利用、菌種的選育上[6]及發酵條件的優化[7]等。馬霞等[8]以酒糟浸出液發酵產細菌纖維素，研究出最優的培養基配；Cheng等[9]以水解玉米桿為碳源，綠色合成細菌纖維素；還有研究用豆渣制備BC[10]。

能夠產生纖維素的微生物主要有9個屬，但真正能夠大批量生產細菌纖維素的只有醋酸菌屬中的幾個種，特別是醋酸菌屬中的木醋桿菌，已成為生產BC的模式菌株[11]。

近年來，由于能源緊缺及各國從環境保護和資源戰略的角度出發，生質柴油發展迅速，甘油作為在生質柴油的煉制過程中含量最高的副產物（約為甘油量的10%），因生產過剩而價格下跌，開發甘油的新工業用途，意義重大。

有鑒于此，本研究利用木醋桿菌，以甘油為主要原料合成細菌纖維素，將可提升生質柴油制程中的附產品甘油的利用率，將其轉化成高附加值的產品——細菌纖維素。并開發A4尺寸大小的細菌纖維素，可以作為面膜裁剪原料，為細菌纖維素的開發利用開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種：木醋桿菌（Acetobacter xylinum）購自上海谷研生物；甘油，工業級，維之城化工有限公司。

1.2 試驗儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-75SII）上海博訊實業有限公司醫療設備廠；恒溫培養箱（DRP-9162）上海培因實驗儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet is5），Thermo Fisher。

1.3 培養基配方

斜面菌種培養基：葡萄糖 5%，蛋白胨0.5%，酵母膏 0.5%，檸檬酸 0.1%，Na2HPO4·12H2O 0.2%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O 0.025%，瓊脂 2%。

種子培養基：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%， 檸檬酸 0.1%，Na2HPO4·12H2O 0.2%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O 0.025%。

液態培養基：甘油（或葡萄糖）2%、酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，檸檬酸0.5%，Na2HPO4·12H2O 0.5%。

所有培養基121℃滅菌20 min。

1.4 三步發酵培養方法

1.4.1 一級種子震蕩培養

取1環活化好的斜面種子接入150 mL種子培養基，充分振蕩，30℃振蕩培養24 h。

1.4.2 二級種子擴大培養

取振蕩培養后的種子培養基，以10%接種量接入相同體積的新種子培養基，30℃振蕩培養20 h。

1.4.3 靜態發酵培養

取二級種子10%接種量接入盛有發酵培養基的培養容器中，30℃靜置培養7 d。

1.5 細菌纖維素的制備

按照上述發酵培養基的濃度配制液態培養基置于250 ml三角錐形瓶中，用矽膠塞將瓶口塞緊，滅菌。待降溫降壓后，無菌操作，接種種子液，充分搖動，使菌落分散均勻，于30℃培養箱中靜置培養，細菌纖維素膜形成后取出。A4尺寸細菌纖維素，選用不銹鋼、玻璃、塑料為材料的容器。

1.6 細菌纖維素的處理

從培養容器中取出細菌纖維素膜，用蒸餾水多次沖洗除去膜表面雜質，直至細菌纖維素膜呈白色半透明狀，再用去離子水反復沖洗至中性，經冷凍干燥36 h后稱重。纖維素產量表示為g（纖維素/干重）/L（培養液）。

1.7 細菌纖維素鑒定

利用傅里葉紅外光譜分析所得產物。

2 結果與討論

2.1 接種量對BC合成的影響

按2%、4%、6%、8%、10% 的接種量，30℃培養 7 d。如圖1所示：不論是以葡萄糖或甘油為碳源，當接種量在2%～6%時，隨著接種量的不斷增加，BC的合成逐漸增多，當接種量為6%時，BC的產量最高。接種量超6%以后，細菌纖維素的產量下降，相同條件下，甘油比葡萄糖合成更多的BC。這是因為木醋桿菌為嚴格好氧菌，在接種量較高的情況下，木醋桿菌數量多，對氧氣的需要量就大，但發酵液的溶氧條件有限，導致細菌因供氧不足影響到BC的合成[12]。接種量也影響培養周期，種子溶液濃度高時，培養周期可以縮短，尤其是延遲期；當接種量太高的時候，往往會導致培養基中的底物在早期消耗過快，不利于后期細菌生長代謝產物的累積[13]。

圖1 接種量對發酵的影響Figure 1 Effect of inoculation amount on fermentation

2.2 甘油濃度對BC合成的影響

甘油濃度為1%、1.5%、2%、2.5%和3%，接種量為6%，30℃培養7 d，甘油濃度對BC合成的影響如圖2所示：當甘油濃度在2%時，BC的合成量為5.2 g·L-1，繼續增加甘油濃度時，產量略有下降，合成BC最適生產的甘油濃度為2%。

圖2 甘油的濃度對細菌纖維素產量的影響Figure 2 Effects of concentration of glycerol on the yield of bacterial cellulose

2.3 培養時間對BC合成的的影響

在培養溫度為30℃，甘油濃度為2%，接種量為6% 的條件下，考察 4、5、6、7、8 d，對細菌纖維素合成量的影響。結果如圖3所示，最佳發酵時間為7 d,呂鴻皓[14]等木醋桿菌利用大豆糖蜜為原料生產BC，最佳發酵時間為6 d。

圖3 發酵時間對細菌纖維素產量的影響Figure 3 Effects of fermentation time on cellulose production

2.4 A4生物細菌纖維素膜的制備

2.4.1 培養模具的選擇

選用不同材料的模具，進行A4大小BC膜的制備，結果如表1所示，以不銹鋼材料的最好，BC膜表面光滑平整，呈乳白色，如圖4，這個尺寸的BC膜可用作面膜材料。

表1 不同材質培養器具對細菌纖維素外觀形態的影響Table 1 Effects of container material on the appearance of bacterial cellulose

圖4 A4大小細菌纖維素Figure 4 A4 size of bacterial cellulose

2.5 紅外光譜分析

從圖5可以看到在3 346 cm-1處有一個強且寬的-OH振動伸縮峰，2 901 cm-1處是-CH的伸縮振動峰，1 643 cm-1處是4半縮醛基團的吸收峰，1 315 cm-1代表C-H的伸縮振動，1 059 cm-1代表C-O-C的伸縮振動[14-15]，這些基團與纖維素的分子結構式中所包含的有機化合物基團基本吻合。

圖5 細菌纖維素紅外光譜圖Figure 5 Infrared spectrum of bacterial cellulose

3 結論

本試驗的結果表明：工業甘油適合做木醋桿菌發酵的基本培養基制備細菌纖維素，其發酵最佳條件為：甘油量2%、接種量 6%、30℃ 靜態培養7 d，細菌纖維素的產量高達5.4 g·L-1。A4尺寸大小的細菌纖維素薄膜制備以不銹鋼盆作為模具效果最好。