制備微藻油脂的轉基因小球藻生長的影響因素分析

李瑤 王雷 付玉杰

摘要：利用從加拿大引進的轉基因小球藻（Chlorella vulgaris）制備微藻油脂，探討影響小球藻生長的條件，如培養基pH、培養溫度等，以期獲得脂肪酸組成以C16和C18為主的藻株及培養條件。結果表明，將轉基因小球藻接種在氮磷質量比為4∶3、pH 8.5的GM-SC培養基中，在28 ℃進行培養，最終可得到生產狀況較好、生長速度較快的小球藻。

關鍵詞：小球藻（Chlorella vulgaris）；微藻油脂；脂肪酸；轉基因

中圖分類號：TK6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）08-1905-03

隨著全世界石油資源日漸枯竭，人類面臨著能源缺乏的危機，同時，人類環境保護意識日漸增強，已逐漸認識到以石油為燃料會造成嚴重的空氣污染，危害人類的身體健康[1]。而且石油燃燒產生的CO2會導致溫室效應，破壞地球的生態平衡[2]。研究表明，生物柴油是最具有發展前途的柴油機替代燃料，是最重要的清潔燃料之一[3]。生物柴油是指以水生植物油脂、動物油脂等為主要原料，在催化劑的作用下通過可再生的動植物油與低碳醇酯交換制成的一種性質與石化柴油非常相似的燃油[4]。生物柴油既可以單獨作為燃料使用，也可以與石化柴油調和使用。混合燃料不但能夠改善柴油機的排放特性[5]，還可以提高柴油的潤滑性。生物柴油作為可再生能源，可緩解人類社會對石油的依賴；對環境友好，大大降低柴油機對空氣的污染；燃點高于石化柴油，處理、運輸、使用和貯藏都變得更加安全和便利。自從1981年南非首次提出生物柴油這一概念后，世界各國都十分關注這種“綠色能源”。現在許多國家都已經開展了生物柴油的研制和生產[6]。

小球藻（Chlorella vulgaris）含有豐富的脂類，是制備生物柴油的重要原料。小球藻的光合作用效率高、生長周期短、生物產量高，而且環境適應能力很強。小球藻是一種單細胞綠藻。改變小球藻培養基的化學成分可以使它的生長方式發生改變，由此提高小球藻的生長效率、獲得高含量脂肪，并且有利于小球藻細胞內的某些代謝產物（如脂類）的積累，降低生產成本[7]。本研究從加拿大引進了轉基因小球藻，它的脂肪酸主要組成為C16和C18脂肪酸，且以C16∶0、C16∶1、C18∶1為主，即雙鍵數目通常為一個，從結構上分析是理想的柴油替代品[8]。本研究探討影響小球藻生長的條件，優化利用轉基因小球藻制備微藻油脂的培養條件，為利用小球藻制備生物柴油打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種 供試小球藻藻種購自加拿大滑鐵盧大學。

1.1.2 培養基

1）GM培養基（1 L）：1.8 g尿素，1.25 g KH2PO4，1.00 g MgSO4·7H2O，0.5 g EDTA，0.114 2 g H3BO4，0.111 g CaCl2·2H2O，0.049 8 g FeSO4·7H2O，0.088 2 g ZnSO4·7H2O，0.014 2 g MnCl2·4H2O，0.015 7 g CuSO4·5H2O，0.004 9 g Co（NO3）2·6H2O。

2）SC培養基（1 L）：1.25 g KNO3，1.25 g KH2PO4，1.0 g MgSO4·7H2O，0.5 g EDTA，0.114 2 g H3BO4，0.111 g CaCl2·2H2O，0.049 8 g FeSO4·7H2O，0.088 2 g ZnSO4·7H2O，0.014 2 g MnCl2·4H2O，0.015 7 g CuSO4·5H2O，0.004 9 g Co（NO3）2·6H2O。

取GM培養基與SC培養基按比例混合制成GM-SC培養基。

1.2 方法

1.2.1 培養基氮磷質量比的優化 向培養基添加尿素、KH2PO4調至氮磷質量比（尿素KH2PO4的質量比）為1∶1、3∶2、4∶3和2∶1，并滅菌備用。在超凈工作臺中將轉基因小球藻藻種分別接種在4種氮磷質量比的GM-SC培養基中，并做好標記。將已接種小球藻的錐形瓶置于恒溫振蕩箱中，溫度調節到30 ℃，光照16 h、黑暗處理8 h，以120 r/min振蕩培養。定期測定其在600 nm下的吸光度，重復3次，取平均值。用OD600 nm變化來表示小球藻的生長情況。

1.2.2 培養基pH的優化 采用最佳氮磷質量比的培養基配方，用0.5 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液調至培養基pH分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，在超凈工作臺中將轉基因小球藻藻種分別接種在6種pH的GM-SC培養基中，并做好標記。將已接種的錐形瓶放置于恒溫振蕩箱中，溫度調節到30 ℃，光照16 h、黑暗處理8 h，以120 r/min振蕩培養。定期測定其在600 nm下的吸光度，3次重復，取平均值。用OD600 nm變化來表示小球藻的生長情況。

1.2.3 培養溫度的優化 將小球藻藻種接種到最適宜條件的培養基中，分別在26、28、30、32 ℃光照16 h、黑暗處理8 h，以120 r/min恒溫振蕩培養，定期測定其在600 nm下的吸光度，3次重復，取平均值。用OD600 nm變化來表示小球藻的生長情況。

1.2.4 脂肪酸的檢測 優化條件后，在最佳條件下培養轉基因小球藻，并委托農業部谷物及制品質量監督檢驗測試中心檢測出轉基因小球藻的C16和C18脂肪酸（亞油酸、油酸、亞麻酸、棕櫚酸和硬脂酸）占總脂肪酸的比例。

2 結果與分析

2.1 培養基氮磷質量比對轉基因小球藻生長的影響

由圖1可知，當培養基中氮磷質量比為4∶3時，轉基因小球藻的生長狀況較好；而當氮磷質量比為2∶1時，轉基因小球藻的生長狀況較差。所以，在試驗的范圍之內，最適宜的氮磷質量比為4∶3。

2.2 培養基pH對轉基因小球藻生長的影響

由圖2可知，這種轉基因小球藻比較適宜在堿性環境下生長，在pH 8.5～9.0的條件下，轉基因小球藻生長較好。在酸性條件下（pH 6.5～7.0），轉基因小球藻生長狀況較差。所以，在試驗的范圍之內，最適宜培養基的pH為8.5。

2.3 培養溫度對轉基因小球藻生長的影響

由圖3可知，轉基因小球藻在28 ℃的培養條件下生長狀況最好，30 ℃的培養條件次之。由此可知，在試驗的范圍之內，最適宜的培養溫度為28 ℃。

2.4 脂肪酸檢測結果

委托農業部谷物及制品質量監督檢驗測試中心檢驗轉基因小球藻的C16和C18脂肪酸（亞油酸、油酸、亞麻酸、棕櫚酸等）占總脂肪酸的比例，結果見表1。可見C18脂肪酸含量較高，C16脂肪酸含量一般，用該小球藻制備微藻油脂相對比較滿意。

3 小結

利用從加拿大引進的轉基因小球藻進行試驗，得出以下結論：將轉基因小球藻接種在氮磷質量比為4∶3、pH 8.5的GM-SC培養基中，在28 ℃的培養條件下進行培養，最終可得到生產狀況較好、生長速度較快的小球藻。試驗優化了利用轉基因小球藻制備微藻油脂的條件，為利用小球藻制備生物柴油打下了基礎。

參考文獻：

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