莖直黃芪中苦馬豆素的提取工藝研究

郝寶成 楊賢鵬 王學紅 陳慧 郭文柱 郭志廷 劉宇 尚若鋒 胡永浩 梁劍平

摘要：以莖直黃芪（Astragalus strictus）為原料，通過單因素試驗、正交試驗和方差分析確定了苦馬豆素的酶法提取工藝條件，并用氣相色譜法測定了提取物中苦馬豆素的含量。結果表明，優化后的莖直黃芪中苦馬豆素最佳提取條件為，粉碎目數80目、料液比1∶40、纖維素酶添加量3.5%、酶解時間3.0 h。在此提取條件下，苦馬豆素的提取率可達到39.41 mg/kg。該法快速、高效、方便、節能，有利于莖直黃芪中苦馬豆素的提取。

關鍵詞：莖直黃芪（Astragalus strictus）；苦馬豆素；纖維素酶；氣相色譜法

中圖分類號：S567.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）08-1886-03

莖直黃芪（Astragalus strictus）為豆科黃芪屬多年生植物，在西藏各地均有分布，每年在其密集生長的牧區都有大批的家畜中毒死亡，是中國西藏牧區危害最嚴重的毒草之一[1，2]。莖直黃芪中的主要有毒成分為苦馬豆素，是一種大極性的吲哚里西丁類生物堿，水溶性極好，經動物腸道吸收后，在溶酶體酸性環境下解離，因其陽離子結構與Α-甘露糖陽離子結構近似，使得競爭結合Α-甘露糖甘酶，不僅抑制了Α-甘露糖甘酶酶活性，同時造成溶酶體內甘露糖不能代謝而蓄積，導致細胞特別是神經細胞的空泡性，從而引起動物中毒[3]。苦馬豆素同時還具有抗腫瘤活性，能特異性地抑制高爾基氏體Α-甘露糖甘酶Ⅱ的活性，同時抑制了腫瘤細胞表面糖蛋白的表達，從而抑制腫瘤的生長和轉移，并能緩解化療和放療中產生的骨髓抑制作用[4]。

目前苦馬豆素的提取主要采用熱回流法、索氏提取法、超聲波提取的常規醇提法[5]。近年來，酶的用途越來越廣泛，涉及的領域也越來越多，生物酶解提取法是利用酶反應的高度專一性，將細胞壁的水解或者降解，破壞細胞壁，從而提高有效成分的提取率。目前，中藥提取方面研究較多的酶是纖維素酶[6，7]，大部分中藥材的細胞壁主要是由纖維素類物質構成的，植物的有效成分往往包裹在細胞內部，用纖維素酶酶解可以使植物細胞壁破壞，有利于有效成分的提取。由于酶制劑在常溫、 常壓條件下就能起催化作用， 能有效地提高植物藥中有效成分的含量。目前關于酶解法提取苦馬豆素鮮有報道。

本試驗為了進一步提高苦馬豆素的提取率、降低生產成本，采用纖維素酶對莖直黃芪進行酶解提取苦馬豆素， 取得了良好的效果，為酶法提取苦馬豆素提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 莖直黃芪（西藏自治區農牧科學院提供）；苦馬豆素標準品（購自西安楊凌天力生物技術有限公司，純度為98.4%）；雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）+三甲基氯硅烷（TMCS）（硅烷化試劑，百靈威公司產品）；纖維素酶（工業級，140萬活性單位）；甲醇、氯仿、正丁醇、吡啶、D-甘露醇等均為分析純。

1.1.2 儀器 氣相色譜儀（VARIAN CP-3380）；色譜柱為瓦里安毛細色譜柱CP-SIL5 CB（15M×0.25 mm×0.33 mm）；KH7200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-5203型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 將莖直黃芪自然條件下戶外晾干，粉碎后過40～80目篩，備用。精密稱取適量莖直黃芪干草粉于燒瓶中，加入一定量pH 4.5的酸水，添加一定量的纖維素酶，在50 ℃下進行酶解反應。反應后將提取液煮沸2 min，過濾，濾液濃縮成浸膏，甲醇溶解，過濾，濾液濃縮成浸膏，用堿性正丁醇溶解浸膏，過濾，回收正丁醇，并用吡啶溶解殘留物作為供試樣品，準確量取吡啶溶液上清液100 μL，分別加入10 μL D-甘露醇標準品溶液和100 μL BSTFA+TMCS（99∶1），室溫條件下干燥器中衍生反應1 h。進行GC分析，記錄色譜峰面積比較分析。每組試驗重復3次，取平均值。

1.2.2 色譜條件 進樣口溫度為260 ℃，火焰離子化檢測器（FID）溫度為260 ℃，柱子初始溫度為150 ℃，程序升溫5 ℃/min（8 min），再程序升溫

30 ℃/min（2 min），氣為高純氮氣，流速為1 mL/min，定量方法為內標工作曲線法。

1.2.3 標準溶液的配置 準確稱取D-甘露醇2 mg，溶于10 mL吡啶中，配成質量濃度為0.2 g/L的溶液。準確稱取1 mg苦馬豆素標準品，用吡啶配成質量濃度為0.1 g/L的標準溶液，并將其分別稀釋為0.05 g/L、0.025 g/L、0.012 5 g/L、0.006 25 g/L、0.003 125 g/L和0.001 562 5 g/L的標準溶液。準確量取標準溶液100 μL，分別加入10 μL內標溶液和100 μL BSTFA+TMCS（體積比為99∶1），供GC分析，繪制標準曲線。

1.2.4 標準曲線的繪制 以標準樣品中苦馬豆素的峰面積和內標峰面積之比為縱坐標，以苦馬豆素的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算出回歸方程y=11.961x-0.004 7，R2=0.999 0。結果表明，苦馬豆素濃度在0.001 562 5～0.1 g/L范圍內呈良好的線性關系。圖1為苦馬豆素標準品色譜圖。

1.2.5 單因素及正交試驗 考察莖直黃芪粉碎目數、料液比、酶添加量、酶解時間對苦馬豆素提取率的影響，在單因素試驗基礎上確定正交試驗工藝參數，通過正交試驗確立最佳提取工藝條件，表1為正交試驗L9（34）的因素和水平。

2 結果與分析

2.1 過篩目數對苦馬豆素提取率的影響

由圖2可知，粉碎后的過篩目數對苦馬豆素的提取率影響較小，當過篩目數在80目時，提取率達到最大值。

2.2 料液比對苦馬豆素提取率的影響

由圖3可知，隨著料液比的增大，苦馬豆素提取率明顯增加，當料液比為1∶40時，提取率達到較大值，此后再增加料液比，提取率增加不明顯。因此，從經濟角度考慮，料液比以1∶40為宜。

2.3 酶用添加量對苦馬豆素提取率的影響

由圖4可知，隨著酶添加量的增加，苦馬豆素提取率逐漸提高，當酶添加量達到3.5%時，提取率基本已達到最大值，繼續增加酶添加量，提取率增加不明顯。因此，確定加酶添加量為3.5%。

2.4 酶解時間對苦馬豆素提取率的影響

由圖5可知，酶解時間在3.0 h之前，苦馬豆素的提取率隨提取時間的延長而上升，當時間達到3.0 h 之后，提取率的增加不明顯，而且時間過長會延長提取周期。因此，確定酶解時間為3.0 h。

2.5 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，對提取莖直黃芪中苦馬豆素的莖直黃芪粉碎目數、料液比、纖維素酶添加量、酶解時間等因素按表1進行L9（34）正交試驗。由表2、3的試驗結果和方差分析可知，各因素影響的主次為D>A>C>B，最佳條件為A3B2C3D2，即正交試驗的最佳工藝條件為莖直黃芪粉碎為80目、料液比1∶40、酶添加量為莖直黃芪的3.5%、酶解時間3 h，按該條件進行驗證試驗，得到苦馬豆素的提取率為39.41 mg/kg。

3 小結與討論

3.1 結論

試驗確定的纖維素酶提取莖直黃芪中苦馬豆素的最佳工藝參數為：粉碎目數80目、料液比1∶40、纖維素酶添加量3.5%、酶解時間3.0 h。其提取條件也溫和，工業生產易于實現，為苦馬豆素的提取提供了一種新方法。

3.2 檢測方法

試驗采用了GC內標法對提取物中苦馬豆素進行檢測，通過苦馬豆素和內標物D-甘露糖峰面積之比進行計算，消除了手動進樣上產生的誤差，使得結果更加準確[8-11]。

3.3 提取方法

由于植物細胞壁的架構物質主要為纖維素、果膠等，特別是纖維素對細胞外壁起到支撐和保護作用，纖維素酶和果膠酶在提取介質中可使纖維素和果膠降解，從而破壞植物細胞壁，有利于提取成分的溶出。因此纖維素酶和果膠酶可有效地提高苦馬豆素的提取率，本試驗僅對纖維素酶進行酶降解提取莖直黃芪中苦馬豆素進行了研究，下一步將會對纖維素酶和果膠酶的復合酶提取方法進行研究，以提高苦馬豆素的提取率。

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