蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348菌株防治番茄灰霉病的效果及機理研究

唐容容 楊文革 胡永紅 江心敏 劉郵洲 章泳

摘要：試驗研究蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）CGMCC4348菌株對番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）的生物防治效果，并初步探討其抑菌機理，以尋找防治番茄灰霉病的新方法。試驗從定量生物測定、室內離體抑菌試驗和盆栽試驗3個方面考察其抑菌作用效果，并以硫酸銨分級沉淀法提取拮抗蛋白進行檢測。結果表明，室內抑菌試驗的EC50為6.19 mg/L；盆栽試驗中處理3對番茄灰霉病的平均防效達75.80%，與50 mg/L嘧霉胺處理的防效相當。試驗證明蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348對番茄灰霉病菌有較好防治效果。

關鍵詞：蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）；番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）；生物防治；CGMCC4348

中圖分類號：S436.3；S476.19 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）08-1817-04

灰霉病可侵染200多種植物的花、果實及其他綠色組織[1，2]，導致組織腐爛，喪失利用價值。近年來中國蔬菜灰霉病發生面積逐年增加，成為蔬菜生產的一大障礙[3]。其中茄科蔬菜以番茄受害最重，一般發病田塊番茄灰霉病造成的產量損失為20%～40%，重病田塊達60%以上[4]。

長期以來生產上主要依靠化學農藥防治灰霉病，病原菌對常用化學藥劑極易產生抗藥性，且長期依賴和大量使用化學農藥會帶來環境污染和食品安全等問題[5-7]。多種真菌、細菌對灰霉病菌均有一定的抑制作用[8]，如木霉、粘帚霉、酵母菌、假單胞桿菌等，近年利用生防菌成為植物灰霉病防治的新策略。作者在番茄病害生物防治研究中篩選到1株可有效抑制番茄灰霉病菌（灰葡萄孢菌，Botrytis cinerea）的生防菌株，經鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），命名為CGMCC4348[9，10]。本研究以室內抑菌試驗與盆栽防效試驗結合的方式來探討該生防菌對灰霉病的防治效果，并提取有效拮抗蛋白進一步探索其抑菌機理，以期為設施茄果類蔬菜病害綠色防控技術提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

生防菌：蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348，南京工業大學生物與制藥工程學院實驗室分離和保存，發酵培養基為YPG培養液[11]，菌種活化與保存采用營養瓊脂培養基[12]。

番茄灰霉病病原菌：灰葡萄孢菌，江蘇省農業科學院植物保護研究所生物防治實驗室分離和保存，采用PDA培養基[13]培養。

1.2 定量生物測定

將番茄灰霉病菌在PDA平板上活化，25 ℃培養待用；活化后的蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348于YPG培養液中28 ℃、140 r/min振蕩培養36 h。

定量生物測定采用平板對峙法，將蠟樣芽孢桿菌菌液稀釋成不同的濃度梯度，每濃度處理重復5次，以無菌液體培養基作為對照，計算菌絲生長抑制率[14]。數據處理采用DPS軟件[15]，建立濃度對數—抑制百分率機率值毒力回歸方程式，計算抑制中濃度（EC50）。

1.3 離體抑菌試驗

取新鮮番茄苗第三、第四片真葉，用無菌水洗凈，置于裝有濕濾紙的培養皿中，打孔器打取灰霉菌菌餅，無菌條件下接于葉片之上。對照，只接灰霉病菌；處理1，接入灰霉病菌36 h后以噴霧方式接入1 mL生防菌發酵液；處理2，噴霧接入1 mL生防菌發酵液后接入生防菌，24 h后接入灰霉病菌。每處理重復5次。培養皿置于人工氣候箱中，溫度28 ℃，光照12 h/d，相對濕度60%。70 h后觀察抑菌效果。

1.4 盆栽防效試驗

將無菌條件下萌發的番茄種子（品種為日本美玉）播于土壤（自然土∶營養土∶蛭石為5∶4∶1）中，溫室育苗，當番茄苗長出4片真葉時盆缽單株移栽。以無菌水洗下番茄灰霉病菌分生孢子，制成4×106個孢子/mL濃度的灰霉孢子懸浮液，以噴霧的方式均勻接種于番茄葉部10 mL，灌根10 mL。生防菌稀釋至1×106 CFU/mL，以噴霧方式接種10 mL于葉片上。各處理如下：對照，只接種灰霉孢子液，后續清水處理；處理1，同時進行灰霉孢子液和生防菌液處理；處理2，灰霉孢子液處理 2 d后，接種生防菌液；處理3，生防菌液連續處理2 d后，接種灰霉孢子液；處理4，灰霉孢子液處理后噴霧50 mg/L嘧霉胺10 mL。每處理60盆，溫室培養。溫室溫度20～25 ℃、相對濕度80%～90%。采用文獻[16]方法統計病情指數及防效。病情分級的根據是葉片病斑面積占整個葉面積的百分比，0級，無病斑；1級，≤5%；3級，5%～10%；5級，10%～20%；7級，20%～50%；9級，≥50%。

1.5 抑菌作用機理試驗

1.5.1 拮抗蛋白的提取 蠟樣芽孢桿菌發酵液4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取離心上清液在室溫下加入硫酸銨，使其飽和度達室溫下的20%，充分攪拌60 min后，于4 ℃、1 2000 r/min離心20 min，收集第一級沉淀物和第一級上清液。將第一級上清液以15%飽和度為梯度，繼續加入硫酸銨充分攪拌，重復上述步驟，收集不同組分的上清液與沉淀。第一、第二、第三、第四級沉淀組分分別記為A、B、C、D。沉淀組分用PBS溶解并透析[17]，得到抗菌蛋白提取液。

1.5.2 發酵液不同組分抑菌效果研究 各組分進行平板對峙試驗。處理1，蠟樣芽孢桿菌發酵液；處理2，發酵液4 ℃、8 000 r/min離心10 min得到的上清液；處理3，相同離心方法得到的不同稀釋梯度沉淀；處理4，硫酸銨分級沉淀得到的蛋白組分A、B、C、D；處理5，去除蛋白組分后的上清液組分，以無菌水處理作為對照。每處理重復5次。

2 結果與分析

2.1 定量生物測定結果

平板對峙試驗結果表明，不同濃度梯度的蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348對番茄灰霉病菌菌絲的生長表現出不同程度的抑制作用，生防菌菌液直接處理的抑菌圈直徑為2.9 cm，抑制率達72.90%，效果最為明顯。利用DPS數據處理系統得到毒力回歸方程及抑制中濃度（表1），其EC50為6.19 mg/L，95%置信區間為0.563 5～25.678 3，模型相關性良好。從相對毒力指數可以看出該生防菌毒力高于灰霉病常用防治藥劑嘧霉胺。

2.2 離體抑菌試驗結果

蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348室內離體抑菌試驗結果見圖1。從圖1可見，蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348對番茄灰霉病有極好的防治效果。對照組番茄葉片發病嚴重，病原菌菌絲茁壯，病部表面產生濃密灰色霉層，凡菌絲觸及的地方葉片腐爛。與對照組相比，處理1葉片上出現較小水漬狀病斑，無菌絲生長，生防菌對灰霉病的發生和蔓延起到了有效的控制作用。處理2中灰霉菌菌絲明顯萎縮，葉片均未發病，表明該生防菌不僅對菌絲生長有極強的抑制作用，還可提高葉片對灰霉病的抗性，保證葉片不發病。

2.3 盆栽試驗中蠟樣芽孢桿菌防治番茄灰霉病效果

盆栽試驗結果（表2）顯示：處理3即生防菌液處理2 d后接入灰霉孢子液防治效果最好，防效為75.80%，與50 mg/L嘧霉胺處理組的防效相當。嘧霉胺是常用的灰霉病防治農藥，但在應用于防治番茄灰霉病過程中病原菌會對其逐漸產生抗性，實用性降低，從試驗看，效果不如蠟樣芽孢桿菌。處理3的防治效果優于處理2，是因為提前對番茄苗接入蠟樣芽孢桿菌菌液，提高了植物的抗性，在等量病原菌處理情況下其發病率更低。Benhamou等[18]、夏立秋[19]的研究也發現蠟樣芽孢桿菌可通過誘導植物產生抗性來發揮生防作用。蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348提高番茄植株對灰霉病抗性的機理有待后續研究。

2.4 蠟樣芽孢桿菌對番茄灰霉病病原菌的抑制作用機理

在平板對峙試驗中發現，生防菌菌落周圍有明顯的抑菌圈（圖2），說明蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348的拮抗作用與胞外分泌的拮抗物質有關。通過對番茄灰霉病病原菌的抑制作用機理試驗結果（表3）可看出，硫酸銨沉淀法提取出的二級蛋白組分B拮抗作用最強，抑制率為68.81%，接近于發酵液對病原菌的抑制率。說明發酵液中存在對番茄灰霉病具有很強抑制作用的拮抗蛋白。除蛋白后的發酵液上清液組分對灰霉菌無抑制效果，說明生防菌產生的拮抗物質主要為胞外蛋白。發酵液離心后的沉淀主要是菌體，其抑菌效果不明顯，抑制率遠低于上清液的55.25%，推測是離心造成菌體裂解，使其活性下降，但該試驗結果不能完全說明菌體對病原菌無抑制作用。在大田環境中，菌體能與病原菌在植物葉片或根、莖上進行營養等生存環境競爭，以定殖方式產生穩定的拮抗作用。大田實際效果有待后續工作中進行深入研究。

3 小結與討論

灰霉病是一種嚴重危害番茄品質和產量的真菌病害，利用具有生防作用的芽孢桿菌屬菌株來防治此類真菌性病害是近年科研工作者研究的熱點之一，其中應用較多的是枯草芽孢桿菌。研究和開發其他芽孢桿菌，增加生防菌在防治過程中的生態多樣性，對生物防治更為有利。試驗首次采用具有自主知識產權的蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348進行定量生物測定、離體抑菌試驗和盆栽試驗，試驗結果證實此菌株對番茄灰霉病病原菌有良好的抑制作用。室內抑菌試驗同時表明該生防菌能分泌抗真菌的拮抗物質，并對病原菌起主要抑制作用。試驗初步提取出具有拮抗作用的蛋白組分，在后續研究中對蛋白組分進行進一步純化，并對其結構與生理生化特性進行深入研究，將對探索生防菌控制植物真菌病害效果的提高和穩定具有重要的理論與實踐價值。室內抑菌試驗與盆栽試驗中生防菌防效與嘧霉胺相當，甚至優于嘧霉胺處理組，在此基礎之上，后續將進行田間防效試驗，并對此菌株進行標記以研究其定殖機理，為研制新型高效的生物農藥提供依據。

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