Zn2+對基因工程大腸桿菌P84A/MC1061發酵生產鹵醇脫鹵酶的影響

潘冬瑞　李嘯　張瑤　李知洪　俞學鋒

摘 要：主要研究Zn2+對基因工程大腸桿菌發酵生產鹵醇脫鹵酶的影響。以鹵醇脫鹵酶活力為響應值，通過單因素試驗篩選出顯著影響因子Zn2+，并確定其最優濃度為0.000 7 g·L-1；在50 L罐中進行分批發酵試驗，比較分析鹵醇脫鹵酶活力、OD600以及在線參數OUR、CER等的變化趨勢，發現Zn2+可顯著促進重組大腸桿菌生長，提高生長速率，酶活提高了5.4%。

關鍵詞：鹵醇脫鹵酶；鋅離子；大腸桿菌；發酵調控

中圖分類號：R378.2+1 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.002

鹵醇脫鹵酶也叫鹵醇-鹵化氫裂解酶，通過分子內親核取代機制催化鄰鹵醇轉化為環氧化物和鹵化氫，是微生物降解此類化合物的關鍵酶之一，在治理環境污染方面具有十分重要作用。此外，在催化環氧化物和鄰鹵醇之間的轉化反應中，鹵醇脫鹵酶具有很高的立體選擇性，因而在手性藥物合成方面也有廣闊的應用前景。序列同源性搜索以及二級、三級結構預測表明，鹵醇脫鹵酶的結構相似于短鏈脫氫酶/還原酶家族（SDRs），它的3個重要的催化殘基分別是：L-Tyr145、L-Ser132和L-Arg149[1-2]。鹵醇脫鹵酶是目前世界范圍內的一個新的研究領域，目前的研究均僅限于鹵醇脫鹵酶基因的改造和優化，對于大腸桿菌發酵生產鹵醇脫鹵酶的影響因素及過程調控的研究甚少。

微生物在生長繁殖和產酶過程中，需要無機鹽維持細胞的滲透壓，并合成核酸等生命物質；某些微量元素如錳、鋅、鐵等對其生理活性物質（酶的活性中心或輔酶）的組成，或生理活性作用調節物（酶的激活劑）的作用有重要影響[3]。

關于Zn2+在生物界中重要性上的認識是個漫長的經歷[4]，包括農業和畜牧業，最后在近100年來，發現在人體生長發育過程中，Zn2+在生理功能上和營養作用上具有極為重要的意義，從生命遺傳物質核酸到代謝參與物—酶，都有Zn2+的作用，因而研究學者稱其為“生命的火花”。但是，Zn2+在微生物代謝過程中的作用等相關研究在國內外成果不多，此方面研究有著十分重要的意義。

筆者主要對Zn2+在大腸桿菌發酵生產鹵醇脫鹵酶的過程進行研究，以確定影響菌體生長及鹵醇脫鹵酶表達的Zn2+的最優百分比，并通過多參數相關分析的方法，探究Zn2+對鹵醇脫鹵酶生物合成影響的原理，為后續發酵過程優化以及生產放大奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 重組大腸桿菌E.coli P84A/MC1061，由安琪酵母股份有限公司菌種室提供。

1.1.2 試 劑 L-阿拉伯糖L（+）-Arabinose，購于Sigma公司。酵母浸出物FM888由安琪酵母股份有限公司生產。其它試劑均為分析純AR。

1.1.3 培養基 斜面培養基（g·L-1）：甘油8，酵母浸出物（FM888）25，NaCl 6.0，KH2PO4 2.5，K2HPO4 2.5，Na2HPO4 5.0，MgSO4·7H2O 1.0，瓊脂粉15。搖瓶液體培養基（g·L-1）：甘油4，酵母浸出物50，NaCl 2.0，KH2PO4 6.5，K2HPO4 6.5，Na2HPO4 3.5，MgSO4·7H2O 1.5，微量元素2。50 L發酵罐液體培養基（g·L-1）：甘油12，酵母浸出物50，NaCl 2.0，KH2PO4 6.5，K2HPO4 6.5，Na2HPO4 3.5，MgSO4·7H2O 1.5。

1.1.4 誘導劑溶液 L-阿拉伯糖濃度0.05 g·mL-1。

1.2 培養方法

1.2.1 搖瓶培養 種子培養：將斜面菌樣接入裝有25 mL液體培養基的250 mL的三角瓶中，在30 ℃和200 r·min-1搖床上培養20 h。發酵培養及誘導產酶：將種子液接入發酵搖瓶后，在30 ℃，200 r·min-1條件下培養，當發酵液OD600達到2時，加入0.5 mL·L-1阿拉伯糖溶液，發酵結束后收集菌體。

1.2.2 發酵罐培養 1級種子培養：將斜面菌樣接入裝有25 mL液體培養基的250 mL的三角瓶中，制備2瓶，在30 ℃和200 r·min-1搖床上培養24 h。2級種子培養：將2 mL 1級種子瓶菌樣，接入裝有100 mL液體培養基的1 L的三角瓶中，制備6瓶，在30 ℃和200 r·min-1搖床上培養20 h。發酵罐分批發酵培養：滅菌前加入15 mL消泡油，滅菌后將6瓶2級種子液合并，接入裝有30 L液體培養基的50 L發酵罐中，在30 ℃、260 r·min-1、0.035 MPa下培養，當發酵液OD600達到2時，加入配制好的L-阿拉伯糖溶液。

1.3 發酵罐調控添加策略

pdr2罐未加入Zn2+；pdr3罐配底料時加入篩選出的最優濃度（0.000 7 mol·L-1）的Zn2+。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 測定項目：pH、OUR、CER、RQ、溫度、攪拌轉速、空氣壓力、空氣流量、溶解氧等。發酵過程中每1 h測1次OD600，每2 h測1次氨基氮和銨根離子，每4 h測1次鹵醇脫鹵酶酶活和胞內胞外Zn2+的含量。

1.4.2 測定方法 菌體量測定方法見參考文獻[5]。鹵醇脫鹵酶酶活力測定方法見參考文獻[6]。鋅離子含量測定用原子吸收法測定[7]。氨基氮測定用甲醛滴定法[8]。用靛酚藍-分光光度法測定銨根離子[9]。

2 結果與分析

2.1 搖瓶試驗

2.1.1 篩選顯著影響因子 試驗發現，一些微量元素對酶的生理活性物質（酶的活性中心或輔酶）的組成或生理活性作用的調節物（酶的激活劑）的作用有重要影響，基于李建華等[3]對于影響鹵醇脫鹵酶活力的6種金屬離子：Zn2+ 、Co2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+和Cu2+的考察，選擇其中較顯著的3種影響因子Zn2+、Co2+和Fe2+進行深入篩選，在離子濃度0，0.000 2，0.000 4，0.000 6，0.000 8，0.001 0，

0.001 2 g·L-1 7個濃度下比較，3種金屬離子在不同濃度下的OD600與鹵醇脫鹵酶活力的變化趨勢如圖1和圖2。

相對空白組而言，Fe2+、Zn2+ 和Co2+對菌體的生長都有一定程度的促進作用，但Zn2+對重組大腸桿菌的生長的促進影響更為顯著（見圖1），且在Zn2+ 濃度為0.000 6 g·L-1菌體濃度達到最大。另外，加Zn2+組對鹵醇脫鹵酶活力的提高也最為顯著（見圖2），Zn2+ 濃度在0.000 8 g·L-1時酶活最高。綜上所述，無論是對重組大腸桿菌菌體生長，還是鹵醇脫鹵酶活力的影響上看，最顯著影響因子為Zn2+，因此后續研究工作圍繞Zn2+展開。

2.1.2 顯著因子Zn2+最優濃度的確定 為進一步找到更準確的Zn2+最優濃度，接下來的研究將縮小濃度梯度，在離子濃度0，0.000 6，0.000 7，

0.000 8，0.000 9，0.001 0 g·L-1 6個濃度下比較，結果見圖3。

由圖3知，縮小Zn2+濃度梯度后，各試驗組中0.000 7 g·L-1濃度下的Zn2+對重組大腸桿菌生長和鹵醇脫鹵酶活力的影響更為顯著，Zn2+最優濃度為0.000 7 g·L-1。

2.2 50 L pdr2、pdr3發酵罐分批發酵結果

在50 L發酵罐中進行分批發酵試驗，添加Zn2+的策略如1.3所示。

兩種控制策略下重組大腸桿菌表達鹵醇脫鹵酶的發酵過程比較如圖4、5和6所示。

由圖4可知，兩罐前2 h的延滯期基本相同，3～7 h pdr3 罐（在底料中加入了最優濃度的Zn2+）的生長速率明顯高于pdr2罐，并在7 h達到最大菌濃。由圖5知，發酵前16 h pdr3 罐的鹵醇脫鹵酶酶活相對于pdr2罐均有一定程度的提高，最大酶活由90 715.60提升至95 590.88，提高了5.4%，而后8 h的酶活兩罐相差不大。pdr3 罐與pdr2 罐比較，其合成最大酶活所需的時間由16 h縮減至12 h。

由圖6知，兩罐的OUR和CER的趨勢基本相似，但pdr3罐對應的呼吸強度略大于pdr2罐，代謝更為旺盛；而對于呼吸熵RQ曲線，pdr3罐的曲線可近似看做是pdr2罐對應的曲線向前平移約3 h所得。

由此推知，Zn2+通過提高重組大腸桿菌E.coli P84A/MC1061的生理活性和生長速率，同時提高其生物積累量而提高了鹵醇脫鹵酶的表達量。

3 結論與討論

綜合以上搖瓶試驗和50 L發酵試驗可知，在底料中加入Zn2+，重組大腸桿菌E.coli P84A/MC1061的生理活性和生長速率得到了明顯提高，菌體的生物積累量增加，鹵醇脫鹵酶的表達量增加，最大酶活由90 715.60提升至95 590.88，提高了5.4%，且最大酶活表達時間提前約4 h。

關于Zn2+生物學功能方面的報道很多。從20世紀60年代開始，如Vallee B L等[10]許多科學研究已經證明：Zn2+是超過120種酶的重要組成部分，同時Zn2+也是所有生物正常細胞生長、發育和分化所不可或缺的。文獻表明，Zn2+對微生物生長及代謝的影響可能有以下幾種途徑和方式：（1）DNA聚合酶[11]和RNA聚合酶[12]都是鋅金屬酶[13]，Zn2+可以決定和穩定核苷酸的信息[14-15]，從而通過改變Zn2+的含量即可影響轉錄和翻譯。故Zn2+可通過影響DNA聚合酶和RNA聚合酶的合成，來影響蛋白質的合成和表達；（2）在糖酵解過程中，Zn2+是磷酸甘油醛脫氫酶、乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶的活化劑。故Zn2+可參與呼吸作用與多種物質代謝過程；（3）Zn2+和氮代謝有密切的關系。Zn2+含量的多少可以調控硝酸還原酶的活性強弱[16]，而硝酸還原酶活性的強弱會影響到氮素的利用和吸收[17]；（4）鹵醇脫鹵酶有3個重要的催化殘基分別是：Tyr145、Ser132和Arg149[1-2]，Zn2+可以與絲氨酸關系密切的色氨酸[12]形成配合物并影響其轉化過程，故Zn2+還可能通過影響鹵醇脫鹵酶的結構、活性中心等，從而直接影響鹵醇脫鹵酶活力；（5）Zn2+含量的改變使得依賴Zn2+濃度的細胞內某些金屬離子（比如：錳、鐵、銅）濃度的變化[18]，從而介導細胞膜發生改變，影響核酸的結構或核酸代謝中涉及的酶活性[19]。

結合本課題研究結果推論得知，Zn2+影響重組大腸桿菌生長及鹵醇脫鹵酶合成的途徑可能為（1）、（2）和（4）。Zn2+通過提高重組大腸桿菌E.coli P84A/MC1061的生理活性和生長速率，同時提高其生物積累量而提高了鹵醇脫鹵酶的表達量。不但最大酶活的表達量提高了，而且最大酶活的表達時間提前約4 h，此研究不但為重組大腸桿菌表達鹵醇脫鹵酶的后續研究奠定了基礎，同時對工業規模鹵醇脫鹵酶的高效生產具有較大的指導作用。

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