光調控因子HY5、HYH在蔗糖誘導花青素積累中作用王立光

李靜雯 葉春雷 陳軍 羅俊杰

摘要：以擬南芥為材料，研究了光調控因子HY5、HYH在蔗糖脅迫下花青素積累過程中的作用。結果表明，蔗糖脅迫環境下誘導的花青素（Anthocyanin）的積累依賴于光，糖脅迫誘導花青素的積累過程必須在光存在的條件下進行，在暗處，即使施加高濃度的糖脅迫，也不能明顯的誘導花青素的產生，且在暗處短期內不會因脅迫時間的延長而改變花青素的積累量。在這個過程中光調控因子HY5、HYH起了重要作用。與野生型擬南芥Col-0、WS相比，缺失突變體在糖脅迫環境下花青素積累明顯減少。

關鍵詞：蔗糖誘導;花青素;HY5;HYH

中圖分類號：Q503 ? ? 文獻標志碼：A ? ? 文章編號：1001-1463（2019）01-0021-05

Abstract：Arabidopsis thaliana was used as the material， the effect of light regulator HY5、HYH on anthocyanin accumulation under sucrose stress were studied. The results indicated that the accumulation of anthocyanin induced by sucrose stress depended on light， and the process of anthocyanin accumulation induced by sucrose stress must be carried out in the presence of light. When high concentration of sucrose stress was applied in the dark， the production of anthocyanin could not be obviously induced. The experiment also proved that the accumulation of anthocyanin in the dark would not change with the prolongation of stress time in a short term. In addition， the ?light regulator HY5 and HYH played an important role in this process. Compared with wild type control， the anthocyanin accumulation of deletion mutants decreased significantly under sugar stress.

Key words：Sucrose-induction;Anthocyanin;HY5;HYH

植物在遭受逆境脅迫時會表現出一系列的表型特征，通常糖脅迫時花青素的積累就是一個重要的表現。已有很多研究表明，花青素對植物抵抗逆境脅迫起到一定的防御作用，雖然植物本身有一套自己的防御自由基和活性氧威脅的防御系統，但是在逆境脅迫下有時這套系統不足以抵抗活性氧或者自由基的攻擊，此時需要花青素發揮作用，對細胞膜和DNA進行保護[1 - 2 ]?；ㄇ嗨氐姆e累情況可以反映植物遭受逆境脅迫的程度，同時具有對逆境脅迫所造成的傷害進行抵御的作用。目前，一方面由于花青素的純天然特性可以使其在生產、生活等領域得到廣泛的安全利用;另一方面由于其在植物生理方面的有益作用，使對花青素的研究也得到足夠的重視，尤其花青素對紫外具有特殊的防護作用，可以使植物免受紫外的傷害，故很多研究者做了大量的研究工作[3 - 6 ]。花青素的積累受光、溫度、激素等外界因素影響已被證 ? 實[7 - 10 ]。植物光形態建成中COP1調節的調控因子HY5、HYH是參與光影響植物的一個重要的組分[11 - 12 ]，光形態建成相關的光調控因子HY5、HYH在逆境脅迫下對花青素的積累所起的作用也就不得不引起人們的關注。我們研究了光調控因子HY5、HYH在糖脅迫環境下對花青素積累的作用，為進一步研究HY5、HYH在調節花青素抵御逆境的作用提供參考。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 植物材料與培養

以野生型擬南芥Col-0、WS及相應的突變體hy5、hyh、hy5 hyh為供試材料。擬南芥種子經20%次氯酸鈉消毒13 min，用無菌水沖洗6次，選取均勻飽滿的種子點于直徑10 cm含有25 mL 1/2MS培養基的培養皿中，4 ℃暗處春化2 d后移入21 ℃的溫室萌發培養4 d。用1/2 MS溶液配制含有不同濃度糖的培養基，對幼苗處理，進行花青素提取測定。

1.2 ? 花青素的提取與測定

花青素提取與測定參照Vandenbussche F方法[13 ]，略有改動。取10 mg的整株擬南芥幼苗放入1.5 mL離心管，加入300 μL酸性甲醇（無水甲醇與HCl的體積比為99∶1），于4 ℃冰箱放置24 h，取出后加入氯仿和蒸餾水各200 μL，稍微振蕩后5 000 r/min離心10 min，吸取上清液350 μL加入700 μL 60%（無水甲醇、HCl、水的體積比為99∶1∶200/3）的酸性甲醇稀釋，530 nm波長下測定吸光值。

1.3 ? 數據分析

利用Microsoft Excel軟件對原始數據進行處理，通過SPSS 20.0軟件對數據進行單因子方差分析，用新復極差法（Duncan）做顯著性分析，利用軟件sigmaplot 10.0和Adobe Photoshop作圖。

2 ? 結果與分析

2.1 ? 光照條件下蔗糖對花青素的積累影響

圖1顯示了蔗糖與光對花青素積累的影響。在蔗糖與光同時存在的情況下，花青素得到了明顯的積累，且隨著處理天數的增加效果更為明顯。在只有蔗糖或者只有光存在的情況下，花青素并未得到明顯的積累，這說明蔗糖對花青素誘導的積累必須在光存在的情況下才可以得到實現，這也與有關糖誘導調節花青素合成相關基因的研究相一致[14 - 15 ]。

2.2 ? 蔗糖濃度對花青素積累的影響

蔗糖濃度不同所引起的糖脅迫程度不同，對花青素積累的影響程度也就不同。為了選擇合適的糖脅迫濃度，利于花青素的測定，選擇0、30、60、90、150 mmol/L的蔗糖濃度進行觀察，結果如圖2所示。在低濃度蔗糖（≤90 mmol/L）有光存在下，隨著蔗糖濃度的增加，花青素積累也隨著明顯增加，當蔗糖濃度達到90 mmol/L時花青素積累已經非常明顯，當蔗糖濃度再增加時花青素含量卻沒有再明顯升高。這說明，在90 mmol/L蔗糖濃度下，花青素積累已達顯著效果，故未特殊說明，均采用90 mmol/L的蔗糖處理。從圖2也可以看出，在暗處雖然也加入了不同濃度蔗糖，但花青素幾乎沒有變化，這也就進一步說明糖所誘導的花青素積累依賴于光。

2.3 ? 蔗糖及葡萄糖、 果糖、 山梨醇對花青素積累影響的比較

在植物的代謝過程中，葡萄糖、果糖是最易利用的單糖。由圖3可知，與二糖（蔗糖）比較，在相同濃度下，對擬南芥花青素合成影響最大的是蔗糖，而非果糖或葡萄糖，這也為選取蔗糖進行處理提供了依據。另外，無論光下還是暗處，山梨醇所造成的干旱脅迫幾乎不能對花青素的積累產生影響。圖3還顯示，雖然葡萄糖或果糖在光下與對照相比花青素的積累有所增加，但是與蔗糖相比，對花青素合成的影響要微弱的多，也就是說雖然不同的糖脅迫都會導致花青素產生和積累，但是同濃度的糖的脅迫程度不同，這從花青素的積累程度可以得到驗證。這3種糖所誘導的花青素的積累都是依賴于光的，在暗處處理的花青素含量與暗處的對照幾乎相同。

2.4 ? HY5、 HYH對蔗糖誘導的花青素的影響

為了進一步研究光在蔗糖誘導花青素積累中的作用，用以野生型Col-0為背景的突變體hy5進行觀察。結果表明，當光調節因子HY5缺失，在蔗糖處理條件下，花青素的積累量明顯減少，只有對照組花青素含量的1/2。在未加入蔗糖條件下，突變體hy5與相應對照的花青素含量沒有差別（圖4），這也就說明光調控因子HY5在蔗糖脅迫誘導的花青素積累過程中起一定的作用，雖然HY5的缺失不能完全抑制蔗糖誘導花青素的產生，但是HY5在此過程中的作用十分重要。

HY5同源基因編碼的光調控因子HYH對HY5有一定的互補作用[16 ]，為了進一步驗證HY5的作用，我們采用野生型WS及相應的單突變體hyh和雙突變體hy5 hyh進一步進行研究。圖5的結果表明，當缺失HYH，在光下蔗糖誘導的花青素的產生量也會較對照相應的減少，也就是說HYH在蔗糖誘導的花青素積累過程中也是起作用的。從圖5中可以看出，雙突變體與相應的野生型和單突變體相比較，花青素的積累量進一步降低，這也就進一步證實2個光調控因子在蔗糖誘導產生花青素的過程中起到了協同作用。但是，在2個因子都缺失的情況下，也不能完全消除蔗糖誘導產生的花青素，使花青素含量達到未脅迫的水平。這表明，除了2個重要的光調節因子之外，還存在其它介導途徑的因子存在，有文獻已經表明這些調節因子在其中的作用[17 ]。

3 ? 結論與討論

我們通過試驗研究了糖脅迫條件下花青素積累對光的要求，并進一步證實光調控因子HY5、HYH在這個過程當中所起的作用。結果表明，糖脅迫誘導花青素的積累過程就必須在光存在的情況下進行。在暗處時，即使施加高濃度的糖脅迫，也不能明顯的誘導花青素的產生，且在暗處短期內不會因脅迫時間的延長而改變花青素的積累量。有研究認為，糖含量的增加有利于花青素的合成[14 ]，但用相同濃度的葡萄糖、果糖處理時并未達到采用蔗糖處理的程度，也就是說蔗糖在為花青素合成提供糖源的同時也造成嚴重的糖脅迫，進而造成花青素的積累。

在負調控HY5、HYH的光調控因子COP1缺失的情況下，擬南芥突變體cop1幼苗黑暗條件下糖處理表現出明顯的花青素積累現象[18 ]。這是由于野生型COP1在暗處能迅速進入核內降解HY5和HYH，而缺失突變體不具備降解能力，這也間接證明HY5、HYH在調控花青素積累過程中起到重要作用。我們的研究也表明，調控因子HY5、HYH在光下低溫引起的花青素積累中具有重要作用，調節低溫脅迫下花青素合成基因的表達，從而影響花青素的積累量[19 ]，這與先前的研究類似。在蔗糖誘導的花青素積累過程中，光形態建成過程中的這2個重要調控因子也起重要作用，但并不是唯一的作用途徑，這也符合植物適應復雜環境從而有多條調節路徑的進化選擇。

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（本文責編：陳 ? ?珩）

收稿日期：2018 - 09 - 19

基金項目：甘肅省農業科學院中青年基金（2016GAAS53）;國家現代農業產業技術體系（GARS-17-SYZ-6）;甘肅省農業科學院科技創新工程（2015GAAS02）;國家自然科學基金（31660391、31460350）。

作者簡介：王立光（1982 — ），男，山東臨沂人，助理研究員，博士，主要從事植物分子與生理研究工作。Email：wodepengyouwlg@163.com。

通信作者：羅俊杰（1962 — ），男，陜西華縣人，研究員，主要從事作物栽培與生態研究工作。 Email： sjsljjie@gsagr.ac.cn。

執 ?筆 ?人：葉春雷