貴州少數民族酸肉、酸魚中乳酸菌的分離鑒定

湛劍龍 陳韻 黃林波等

摘要：采用傳統微生物分離方法進行乳酸菌純種分離，利用16S rRNA序列分析方法進行乳酸菌鑒定，從7個酸肉、酸魚樣品中共分離出14株乳酸菌，有乳桿菌屬、環絲菌屬、乳球菌屬3個屬，9個種。從其中鑒定出7株乳酸菌，分別是：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）、泡菜乳桿菌（Lactobacillus kimchi）、清酒乳桿菌亞種（肉）（Lactobacillus sakei subsp. carnosus）、草乳桿菌（Lactobacillus graminis）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）。

關鍵詞：酸魚；酸肉；乳酸菌；分離鑒定

中圖分類號：TS214.2 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）07-0040-04

貴州黔東南苗族、侗族自治州傳統發酵酸肉/魚制品主要是以豬肉和魚肉為原料，洗凈后加入一定量的鹽腌制2～3d，再根據當地的飲食習慣多加甜酒、熟糯米、生姜、花椒、辣椒粉、大蒜等輔料，裝入壇、瓦缸、木桶等容器中，上層用葉片、塑料和水來隔絕空氣，放置于避光陰涼地方自然發酵。此方法是當地居民延續祖先智慧結晶一代一代傳承下來的，具有歷史悠久、風味獨特、安全和綠色的特點。但由于傳統手工工藝制作，發酵時間長，沒有大規模的生產和市場上流通，其他地域的人們無法享受這種風味獨特的發酵肉制品[1-3]。乳酸菌是發酵肉制品中的優勢菌群，對發酵產品的風味和營養品質變化起著至關重要的作用[4-7]。目前，對于貴州傳統少數民族發酵肉制品中乳酸菌的研究還相當缺乏[8]。因此，本研究以貴州少數民族地區侗族發酵酸肉和苗族發酵酸魚為材料，采用傳統微生物分離方法進行乳酸菌純種分離，利用16S rRNA序列分析方法進行乳酸菌鑒定[9-12]，旨在從原生態食品中發掘有益乳酸菌，以利于進一步研究乳酸菌的發酵特性、改進傳統工藝，為保護、利用本土原生態的微生物資源打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

實驗原料來自于貴州省黔東南州從江縣及黎平縣農戶家純手工制作的酸肉、酸魚，共7個樣品，其中酸肉4個樣品，酸魚3個樣品，采樣時嚴格按照國標GB/T4789.1—2010《食品安全國家標準：食品微生物學檢驗》操作。酸肉、酸魚樣品分別編號如表1所示。

1.1.2 培養基及主要試劑

培養基：MRS肉湯培養基、PY培養基、PYG液體培養基（在PY培養基中添加10g/L葡萄糖）。

主要試劑：革蘭氏染色試劑、細菌微量生化鑒定管（麥芽糖、乳糖、葡萄糖）、試劑A（α-萘酚5g和95%體積分數乙醇100mL）、試劑B（KOH 80g、肌酸（Creatine）0.6g、蒸餾水200mL）、溶菌酶、CTAB（十六烷基三甲溴化胺）裂解液、Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇、聚乙二醇均為分析純。

1.2 儀器與設備

CX21SF1奧林巴斯生物顯微鏡 奧林巴斯（中國）有限公司；S1000TM Thermal Cycler PCR儀、DcodeTM Universal Mutation Detection System DGGE電泳儀、Gel DocXR凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；Gilson P型移液器 法國吉爾森公司；Micro 17R微量高速冷凍離心機 美國Thermo Electron公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化

取3g樣品，剪碎放入MRS液體培養基中， 36℃恒溫厭氧培養48h，然后稀釋5個梯度（10-1～10-5）后，直接涂布于MRS固體培養基上，36℃恒溫厭氧培養48h。再采用平板劃線法對涂布平板中不同的單個菌落進行接種、培養，并進行革蘭氏染色和鏡檢，重復分離純化直至鏡檢結果一致。

1.3.2 菌株分類鑒定方法

1.3.2.1 菌落特征

對純化菌株在MRS固體培養基上的菌落特征進行觀察、記錄和編號，主要包括菌落大小、形狀、顏色、濕潤度、光澤度、透明度、隆起形狀、邊緣特征等。將初步認定為乳酸菌菌株進行革蘭氏染色鏡檢。

1.3.2.2 菌種分類生理生化試驗

主要生理生化試驗包括：接觸酶試驗、甲基紅試驗、乙酰甲基甲醇（voges-proskauer，VP）試驗、石蕊牛奶試驗、淀粉水解試驗、葡萄糖產酸試驗和糖發酵試驗[13-15]。

1.3.3 菌株DNA的提取

參照譚映月等[16]提取DNA方法，有所改動。取備用菌株菌液2mL于2mL離心管中，8000×g離心8min，收集沉淀；加200μL溶菌酶（質量濃度為0.05g/mL），置于35℃水浴2h；加2%十六烷基三甲基溴化銨（Hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）裂解液0.5mL，上下顛倒混勻10min；加0.5mL Tris-飽和酚：氯仿：異戊醇=25：24：1，上下顛倒混勻2min后，于10000×g離心5min；收集上清液轉入新的離心管，加入等體積的氯仿：異戊醇=24：1，上下顛倒混勻2min后于10000×g離心5min；收集上清液轉入新的離心管，加入2倍體積30%聚乙二醇于4℃條件下沉淀4h；取出離心管于14000×g離心8min，倒掉上清液，用70%體積分數乙醇洗滌DNA 3次，經真空干燥后轉入0.2mL PCR管，加50mL TE（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0）緩沖液于―20℃保存。

1.3.4 PCR擴增細菌16S rRNA全長[17]

采用細菌通用引物：27F：5'- AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'- GGTTACCTTG TTACGACTT-3'。

25μL反應體系：1μL模板DNA，引物（1μmol/L）各2.5μL，Go Taq Green Master Mix（2×）12.5μL，去離子水6.5μL。反應程序：95℃預變性2min；25個循環包括：94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min；最終72℃延伸2min。用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.3.5 數據分析方法

取PCR擴增產物送上海生工公司進行測序分析，在ABI DNA自動測序儀上進行測序反應。登陸NCBI網站，與已知基因序列進行比對。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離

對來自貴州黔東南苗族、侗族自治州的發酵酸肉、酸魚7個樣品中的優勢乳酸菌群進行分離及純化，共得到14株純菌株。從SR1中分離出2株，SR2中分離出1株，SR3中分離出3株，SR4中分離出2株；從SY1中分離出1株，SY2中分離出2株，SY3中分離出3株。從SR2只分離出1株乳酸菌，由于酸肉發酵時間超過1年，其中的優勢乳酸菌群已經十分穩定，其他菌群在發酵過程中處于競爭劣勢，隨著時間的延長逐步消亡；SR3中分離出3株，是酸肉樣品中發酵時間最短的，僅3個月，也是分離出優勢乳酸菌最多的。

2.2 菌株分類鑒定

2.2.1 形態學觀察

將14株菌接種于MRS固體培養基上，置于37℃培養24h后鏡檢觀察，菌落形態特征如表2所示。

2.2.2 生理生化試驗

14株菌進行的生理生化試驗結果如表3所示。試驗結果表明：14株菌株均能使石蕊牛奶變為粉紅色，表明14株菌均能在石蕊牛奶中產酸；14株菌均能是使粉紅色的石蕊牛奶凝固，表明14株菌產酸能力很強；只有SR2、SR3-1、SR3-2、SR4-1這4株菌能使牛奶清澈，表明只有它們能產蛋白酶。所有14株菌過氧化氫酶全部為陰性，乙酰甲基甲醇試驗、甲基紅試驗全部為陽性，淀粉水解試驗中，除SR1-1、SR1-2為陰性外，其余菌全部能水解淀粉。糖發酵試驗表明：14株菌培養24h后均能發酵葡萄糖產酸使細菌微量生化鑒定管中葡萄糖培養液變為黃色，呈陽性。除SR2和SR3-1未能完全發酵麥芽糖，導致管內為半黃半紫；其余12株菌均能使均能發酵麥芽糖使培養液變為黃色，呈陽性；在乳糖發酵中，SR1-1、SR1-2和SR2未能發酵乳糖，顏色仍為藍紫色，呈陰性，SR3-1、SR3-2、SY2-1、SY2-2和SY3-3不完全發酵乳糖，使管中乳糖培養液為半黃半紫；SR3-3、SR4-1、SR4-2、SY1、SY3-1和SY3-2均能發酵乳糖，使管內乳糖培養液完全變為黃色，呈陽性。

2.2.3 菌株擬鑒定結果

參考《常見細菌鑒定手冊》[18]及《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[19]對14株菌進行形態學特征和生理生化試驗分類鑒定，由菌落形態、革蘭氏染色、接觸酶試驗、甲基紅試驗、乙酰甲基甲醇試驗、石蕊牛奶試驗、淀粉水解試驗、葡萄糖產酸試驗、麥芽糖和乳糖發酵試驗等結果表明，14株細菌均為乳酸菌，并確定有乳桿菌屬、環絲菌屬、乳球菌屬3個屬。

2.3 DNA測序結果及分析

2.3.1 DNA提取結果檢測

選取7株乳酸菌提取的DNA經瓊脂糖電泳后的凝膠于凝膠成像如圖1所示。采用溶菌酶消化裂解法提取的DNA條帶清晰，主帶明顯，不過此法所提DNA出現拖尾，分析原因可能是提取過程中DNA條帶被打斷或者是RNA干擾所致。

2.3.2 PCR擴增結果

7株菌DNA經正反2種引物擴增各樣品的16S rRNA 如圖2所示，全長效果均良好，條帶清晰。

2.3.3 測序結果

7株菌16S rRNA序列與美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數據庫與已知細菌基因序列進行比對，結果見表4。

從表4鑒定結果可知，所鑒定7株細菌全部為乳酸菌，與NCBI數據庫已知菌株序列的相似性達99%。SR2號菌鑒定為泡菜乳桿菌（Lactobacillus kimchi），SR3-1號菌為消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius），SR3-3號菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），SR4-1號菌為草乳桿菌（Lactobacillus graminis），SR4-2號菌為彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus），SY3-1號菌為清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei），SY3-3號菌為清酒亞種（Lactobacillus sakei subsp. carnosus）。其中植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌和清酒乳桿菌亞種4株菌的分離鑒定、益生特性及在發酵肉質品中的作用均有研究，而消化乳桿菌、草乳桿菌、泡菜乳桿菌[20]的相關研究報道很少。

3 結 論

傳統酸肉和酸魚中乳酸菌群在發酵過程中隨著時間延長，優勢乳酸菌群種類逐漸減少，最終趨近穩定，一般優勢乳酸菌群只有1～2種；由于地域不同，制作工藝有差異，酸肉和酸魚中優勢乳酸菌群也不相同。本研究從7份樣品酸肉/魚中，共分離出乳酸菌14株，目前鑒定出7株乳酸菌，分別是：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）、泡菜乳桿菌（Lactobacillus kimchi）、清酒亞種（Lactobacillus sakei subsp. carnosus）、草乳桿菌（Lactobacillus graminis）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）。本實驗分離鑒定出酸肉、酸魚中的乳酸菌有利于了解其中的乳酸菌群，為揭示酸肉、酸魚發酵機理，擴大市場，發掘其中的益生乳酸菌打下基礎。

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