花生肽的體外抗氧化活性研究

彭維兵，陳維云，王雪，陳錫強，劉可春

(山東省科學院生物研究所，山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250014)

現代科學研究表明，自由基在人體的衰老和腫瘤的發病過程中起著非常重要的作用，尤其是羥自由基和超氧陰離子與心血管疾病、癌癥、高血壓、炎癥的休克等都有密切的關系［1－4］。機體抗氧化酶的活性降低和過多自由基的生成，致使人體內積蓄了大量的氧自由基，活性氧自由基的平衡被打破，從而過量地損傷細胞，進而危害人類的健康。因此，研究并開發高效低毒性的、能夠保護人類機體免受過量自由基損害的藥物或者保健品，成為人們關注的熱點［5－8］。

目前，抗氧化劑大多為合成的物質，純天然的物質并不多見。本課題組從純天然食品花生中提取、分離得到了分子量在1 kD以下的花生肽，并對花生肽的作用，如對小鼠的抗運動性疲勞作用、四氯化碳致小鼠肝損傷的保護作用及對原發性高血壓大鼠的降壓作用進行過較為系統的實驗研究，證實了其在上述各方面的藥理活性［9－11］。本文將繼續探討花生肽的體外抗氧化活性，為其廣泛應用提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 藥物與試劑

花生肽樣品:實驗室自制，分子量在1 kD以下;Tris-Hcl，硫代巴比妥酸(TBA)，1，1-二苯基-2-三硝苯肼(DPPH)，三氯乙酸(TCA)，butylated hydroxytoluene(BHT)均購于Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA);硫酸亞鐵，無水乙醇，過氧化氫等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器

Anke TGL-16C/Anke TDL-5離心機，上海安亭科學儀器廠;BIO-TEK全自動酶標儀，美國。

2 實驗方法

2.1 DPPH自由基的清除能力的測定［12］

準確稱取DPPH樣品4 mg，用無水乙醇溶解并定容于100mL容量瓶中，得到濃度為0.04 mg/mL的DPPH 母液，于0 ～4℃避光保存。將花生肽樣品配成濃度分別為 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL 的樣品溶液，并將濃度為0.04 mg/mL的DPPH溶液4 mL與上述溶液各1 mL分別加入試管混合，充分搖勻，在暗室中放置30min后，以無水乙醇作為空白對照，以BHT作為陽性對照，在517 nm下用酶標儀測定吸光度值A，并用下列公式計算清除率，清除率數值越大表示其抗氧化能力越強。

清除率=［(A0–A1)/A0］×100%，

其中:A0為4.0mL DPPH溶液和1 mL無水乙醇的吸光度值;A1為4.0mL DPPH溶液和待測溶液的吸光度值。

2.2 還原力的測定［13］

分別取 1.0mL 濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1 mg/mL 的花生肽被測溶液加入試管中，再加入 2.5 mL 濃度為0.01 mg/mL的鐵氰化鉀和2.5 mL pH值為6.6、濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，均勻混合，放置于50℃的電熱恒溫水浴鍋中反應20min，然后加入2.5 mL濃度為0.1 mg/mL的三氯乙酸，充分搖勻，并3500 r/min離心10min。吸取2.5 mL上清液，加入濃度為0.01 mg/mL的三氯化鐵溶液0.5 mL和蒸餾水2.5 mL。在700 nm波長下測定樣品吸光度值。

2.3 抗脂質過氧化能力的測定［14－15］

首先配制pH值為7.45濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)，用其按照1:25的比例配制成卵黃懸液。在試管中分別加入濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 和6.4 mg/mL 的被測溶液 1.0mL，再加入濃度為25 mmol/L的硫酸亞鐵0.4 mL和0.4 mL卵黃懸液，最后用pH值為7.45濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液補充至4 mL，在37℃氣浴恒溫振蕩器中振蕩15 min后，加入濃度為20mg/mL的三氯乙酸(TCA)1.0mL，靜置10min，并3500 r/min離心10min，吸取上清液4 mL，加入濃度為0.8mg/mL的TBA 2 mL，于沸水浴中15 min，冷卻，以6 mL PBS為空白管調零，以BHT作為陽性對照，在532 nm下用酶標儀測定吸光度值，用對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制率表示樣品的抗氧化活性，用下列公式計算:

抑制率I%=(A0－A)/A0×100%，

其中，不加樣品管的吸光度為A0，樣品管的吸光度為A，

2.4 統計學方法

3 實驗結果

3.1 花生肽對DPPH自由基的清除能力

由圖1可知，在0.1～3.2 mg/mL濃度范圍內，維生素C對DPPH自由基的清除率基本保持不變，其清除率在92.4%左右。花生肽對DPPH自由基的清除率隨濃度增加逐漸上升，當濃度達到3.2 mg/mL時，花生肽對DPPH自由基的清除率為78.7%，但低于維生素C。

3.2 花生肽的還原能力

從圖2可知，在0.1～1 mg/mL濃度范圍內，隨著花生肽濃度的增加，其還原能力增強。維生素C在0～0.2 mg/mL濃度范圍內，還原能力逐漸增強，在濃度為0.2 mg/mL時，還原能力達到2.8。花生肽樣品濃度在1 mg/mL時，還原能力達到1.7。表明花生肽樣品具有一定的還原能力，但還原能力不如維生素C強。

圖1 花生肽在不同濃度下清除DPPH自由基能力分析Fig.1 Analysis of DPPH free radical scavenging capability of peanut peptides under different concentrations

圖2 花生肽在不同濃度下的還原能力分析Fig.2 Reducing capability analysis of peanut peptides under different concentrations

3.3 花生肽抗脂質過氧化能力的測定

圖3表明，在0.2～6.4 mg/mL濃度范圍內，維生素C對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制率基本保持不變，其抑制率在95%左右。花生肽對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制率隨濃度增加逐漸上升，當濃度達到6.4 mg/mL時，花生蛋白肽對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制率為78.6%。

圖3 花生肽在不同濃度下抗脂質過氧化能力分析Fig.3 Analysis ofanti-lipid peroxidation capability of peanut peptides under different concentrations

4 結論

花生肽作為純天然的保健食品，在人們的生活中已經得到廣泛應用，但是對分子量在1 kD以下的花生肽的相關研究較少。本文對花生肽的體外抗氧化作用進行了初步探討，證實了花生肽對DPPH自由基具有較好的清除能力和一定的還原能力，并對卵黃脂蛋白脂質過氧化具有較好的抑制作用，具有進一步開發成為保健食品的可行性。

在以前的研究中，作者也驗證了花生肽的抗疲勞、治療肝損傷和降血壓的作用。這些較為系統的研究，為花生肽開發成為具有多種功效的保健食品提供了理論依據。

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