12-脂加氧酶抑制劑黃芩素對病毒性心肌炎小鼠動物模型的干預作用研究

韓 明,韓燕燕,劉仕成

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是兒科臨床常見的心血管疾病，其發病有上升趨勢，VMC可伴有心功能障礙或嚴重心律失常，并且已成為青少年不明原因猝死的主要原因之一，不僅如此，慢性VMC還可導致擴張性心肌病的發生，嚴重危害小兒生命健康。因VMC發病機制尚未完全闡明，至今國內外對VMC尚無特效的治療方法。12-脂加氧酶(12-LO)是一類以非血紅素鐵蛋白為輔基的多功能酶，屬于脂質酶家族中的一種，廣泛分布于機體各部分，具有多種生物功能[1]。12-LO也是一種重要的信號分子，能夠促進細胞增殖，通過機體氧化應激反應和炎癥反應，參與了高血壓、動脈粥樣硬化等多種疾病的病理過程[2]。本研究旨在探討12-LO抑制劑黃芩素對小鼠VMC發病的影響，為黃芩素治療VMC的可行性提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立[3]及實驗分組 選取4周齡純種近系BALB/C雄性小鼠250只，飼養于清潔級環境中，體質量(16±1) g，狀態良好，活躍，飲食正常，由吉林大學基礎醫學院動物實驗中心提供。實驗前稱量小鼠的體質量并做記錄，采用計算機隨機分組的程序隨機分成5組，每組50只。A 組：正常小鼠空白對照組，不給予病毒，每只小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.1 ml；B組：模型組，每只小鼠腹腔注射10-2TCID50柯薩奇B3病毒(CVB3)0.1 ml，在腹腔注射病毒后2 h，每只腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.1 ml；C組：高劑量治療組，每只小鼠腹腔注射CVB3 0.1 ml，在腹腔注射病毒后2 h，每只腹腔注射0.4 g/L黃芩素溶液0.5 ml；D組：中劑量治療組，每只小鼠腹腔注射CVB3 0.1 ml，在腹腔注射病毒后2 h，每只腹腔注射0.2 g/L黃芩素溶液0.5 ml；E組：低劑量治療組，每只小鼠腹腔注射CVB3 0.1 ml，在腹腔注射病毒后2 h，每只腹腔注射0.1 g/L黃芩素溶液0.5 ml。以上小鼠腹腔注射CVB3共3 d，藥物治療連續21 d。分別于第4、7、14、21天隨機取部分小鼠待用。

1.2 各組小鼠一般情況 A組50只小鼠未出現任何癥狀，無一例死亡。B組小鼠在接種病毒后第3天出現毛發松散、粗糙灰暗，不思飲食，稀便，行動遲緩，對刺激反應減退等癥狀，第4天有死亡，第7～14天是死亡的高峰，第14天后癥狀減輕。50只小鼠中有45只感染VMC，發病率為90%；21 d內共死亡14只，死亡率為28%。C、D、E組分別有44、47、46只小鼠感染VMC，發病率分別為88%、94%、92%。C組小鼠從病毒接種后21 d內共死亡1只，死亡率為2%。D組小鼠從病毒接種后21 d內共死亡6只，死亡率為12%。E組小鼠從病毒接種后21 d內共死亡8只，死亡率為16%。

1.3 心肌組織病理學檢查 各組小鼠均于第4、7、14、21天隨機抽取小鼠8只，拉頸脫臼處死。取小鼠心臟組織用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，常規蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察心肌組織的病理變化；并根據Rezkalla半定量分析法[4]計算心肌病變積分：即每張切片隨機取5個高倍鏡視野,計算炎性細胞浸潤、心肌壞死面積占整個切片心肌面積的百分比。病理積分標準：無炎性細胞浸潤、心肌壞死計0分，炎性細胞浸潤、心肌壞死<25% 計1分，25%～50% 計2分，51%～75% 計3分，>75%計4分。

1.4 反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法檢測心肌組織中12 - LO mRNA的表達情況 按照RT-PCR一步法試劑盒說明書進行操作(RT-PCR試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司)。PCR反應條件：95 ℃預變性120 s，94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s， 循環35次，最后72 ℃延伸7 min。PCR擴增產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以DL-2000 作相對分子質量對照，同時各組均擴增β-actin作為內對照。引物序列：12-LO mRNA上游5′-ACTCCCATTGAGCCTAAA-3′，下游5′-GGAGCAACACCTTGGAAA-3′；內對照β-actin上游5′-CGTTGACATCCGTAAAGACAGG-3′，下游5′-TGGAAGGTGGACAGTGAG-3′。擴增產物長度分別為12-LO mRNA 450 bp，β-actin 201 bp。擴增產物序列測序通過GenBank獲得(通過primer 5.0設計，由大連寶生物有限公司合成)，并對數據進行半定量分析，用美國Pharmacia biotech公司凝膠成像分析系統掃描測定PCR產物電泳條帶密度，按下列公式計算12-LO mRNA相對表達量，12-LO mRNA相對表達量=12-LO mRNA電泳條帶密度/β-actin電泳條帶密度。

1.5 血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平檢測 小鼠眼眶采血，分離血清，應用Beckman-Coulter ACCESS微粒子全自動化學發光免疫分析儀檢測 CVB3感染后的BALB/C小鼠血清CK-MB水平。

2 結果

2.1 各組小鼠心肌組織病理積分 5組小鼠各時間段的心肌組織病理積分比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中B組小鼠各時間段心肌組織病理積分均高于A 組,差異有統計學意義(P<0.01)；C、D、E組小鼠各時間段心肌組織病理積分均低于B組,差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

Table1 Comparison of myocardial tissue pathological score of mice in five groups at different time

組別只數第4天第7天第14天第21天A組80000B組8120±033▲303±046▲277±072▲110±049▲C組8077±023△154±061△089±056△043±031△D組8090±028△183±063△107±050△050±033△E組8108±035△213±074△124±061△067±042△F值2451379727641023P值<005<005<005<005

注：與A組比較，▲P<0.01；與B組比較，△P<0.05

2.2 各組小鼠血清CK-MB水平 B組小鼠CVB3接種后第4天CK-MB水平即有改變，第7～14天達到高峰，第21天降低。B組與A組相比，第4、7、14天血清CK-MB水平差異具有統計學意義(P<0.05)。C、D、E組小鼠第4、7、14天的血清CK-MB水平與B組相應時間段比較均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，但仍未降到正常水平，見表2。

Table2 Comparison of serum CK - MB level of mice in five groups at different time

組別只數第4天第7天第14天第21天A組8121±107 131±102 114±103 102±110B組8374±155▲598±236▲484±171▲263±237C組8305±124△371±212△347±101△237±204D組8346±156△544±245△434±122△242±211E組8351±136△528±241△427±178△253±216F值451890627088P值<005<005<005>005

注：與A組比較，▲P<0.01；與B組比較，△P<0.05

2.3 各組小鼠心肌組織12-LO mRNA相對表達量 不同時間段各組小鼠心肌組織12-LO mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)。B組小鼠各時間段心肌12-LO mRNA相對表達量均高于A 組，差異有統計學意義(P<0.01)； C、D、E組小鼠心肌組織12-LO mRNA相對表達量除第4天外，其他各時間點的表達量均低于B組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。注藥第7天各組小鼠心肌組織中均有12-LO mRNA的表達，其中A組小鼠心肌組織12-LO mRNA低表達， B組小鼠心肌組織12-LO mRNA高表達， C、D、E組小鼠心肌組織中12-LO mRNA的表達均低于B組(見圖1)。

2.4 12-LO mRNA表達量與心肌組織病理積分的關系 C、D、E組小鼠12-LO mRNA表達量與心肌組織病理積分均呈正相關(C組：r=0.892，P<0.01；D組：r=0.520，P<0.05；E組：r=0.364，P<0.05)。

Table3 Comparison of 12-LO mRNA in myocardial tissue in five groups at different time

組別只數第4天第7天第14天第21天A組80109±0013 0113±0021 0121±0023 0117±0019 B組80623±0321▲1311±0208▲1018±0302▲0512±0025▲C組80578±0332 0789±0211△0667±0236△0413±0089△D組80611±0267 0945±0247△0784±0345△0473±0113△E組80619±0257 1109±0301△0855±0349△0591±0101△F值571415234831205P值<005<005<005<005

注：與A組比較，▲P<0.01；與B組比較，△P<0.05

注：1為DL-2000 Marker，2為A組，3為B組，4為C組，5為D組，6為E組，7為陰性對照組

圖1 RT-PCR檢測心肌12-LO電泳結果

Figure1 The agarose gel electrophoresis results of 12-LO of mice myocardial tissue detected by RT-PCR

2.5 12-LO mRNA表達量與血清CK-MB水平的關系 C、D、E組小鼠心肌組織12-LO mRNA表達量與血清CK-MB水平均呈正相關(C組：r=0.906，P<0.05；D組：r=0.492，P<0.05；E組：r=0.327，P<0.05)。

3 討論

通過CVB3感染BALB/C小鼠來誘發VMC，是構建CVB3 VMC模型的經典方法。VMC基本病理改變是心肌間質的炎性細胞浸潤和心肌細胞的變性、壞死以及晚期出現纖維化改變等，本實驗中心肌組織病理學檢查結果顯示空白對照組各期小鼠心肌組織均無病理變化，心肌肌纖維分布正常；模型組小鼠各時間段的心肌組織符合VMC的病理變化。另外，小鼠血清心肌酶的改變可作為心肌細胞損傷的標志之一。臨床上常檢測的心肌酶指標包括乳酸脫氫酶(LDH)、α-羥丁酸脫氫酶(α-HBDH)、肌酸激酶(CK)、CK-MB。其中CK-MB是CK的同工酶之一，CK-MB大量存在于心肌組織中，在骨骼肌等組織內也有少量存在，是心肌受損的急性期診斷指標。本實驗目的在于觀察小鼠在病毒接種后所發生心肌損害的動態變化，所以在評價心肌壞死的范圍及過程時檢測了CK-MB；結果顯示，模型組小鼠血清CK-MB水平在第4天時即開始升高,在第7天時明顯升高，并達到高峰，以后略有下降，第21天下降明顯，提示在CVB3感染初期小鼠心肌即出現損傷，有不同程度的炎性病變，而在CVB3感染后期該指標有所下降，說明心肌可能出現一定程度的修復。經12-LO抑制劑黃芩素治療的各組小鼠與模型組比較，各時間點小鼠心肌組織病理積分均減少，血清CK-MB水平降低(第21天除外)，提示黃芩素可減輕VMC病情。

近年來對12-LO的研究較多，其為重要的信號分子[5]，生長因子、細胞因子以及高糖均能刺激血管平滑肌細胞、單核細胞的12-LO 表達上調，大鼠頸動脈氣囊損傷后損傷區12-LO表達明顯增加，而且12-LO還參與了氧化應激和過氧化物的形成，抑制動脈硬化程度。目前把心肌炎和12-LO聯系在一起的文獻很少，本實驗通過RT-PCR半定量分析發現，空白對照組小鼠心肌組織12-LO mRNA呈現低表達量，模型組小鼠心肌組織12-LO mRNA表達量較空白對照組明顯增高，病毒感染后第4天12-LO mRNA表達開始升高，之后逐漸增高，第7～14天達高峰，而后隨時間的延長而略有下降，但仍維持在一個較高水平，提示CVB3病毒感染后14 d內小鼠心肌組織中12-LO的表達呈時間依賴性。說明12-LO參與VMC的發生和發展。本實驗結果還顯示心肌組織病理積分和血清CK-MB水平與12-LO mRNA 表達量之間呈正相關關系，在一定程度上反映了VMC小鼠病情嚴重程度，提示12-LO的高表達可導致心肌損傷，且與VMC的病理過程密切相關。據此推測12-LO可能成為VMC治療的一個潛在的、有價值的靶點。

12-LO抑制劑黃芩素因其具有特異的作用靶點和良好的實驗研究效果，有學者對其治療疾病的機制進行了研究[6]。黃芩素不僅具有多種藥理活性，也是12-LO的特異性抑制劑，在由12-LO介導的疾病中發揮著積極作用[7-8]。本實驗結果表明，不同劑量的黃芩素均能有效降低小鼠心肌組織12-LO表達量，提示特異性12-LO抑制劑黃芩素對小鼠VMC具有一定的治療效果，通過干預12-LO的作用，可能會減輕VMC的心肌病理損害程度。由此推測黃芩素治療VMC的可能機制是通過抑制12-LO，減輕氧化應激反應，改善小鼠心肌組織的病理變化，保護心肌細胞，為開發治療VMC的新藥提供了實驗依據。

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6 王雪峰,劉芳,謝彬,等.不同提取方法的黃芩制劑體外抗柯薩奇病毒B3m和保護細胞作用的比較研究[J].中國藥學雜志，2006,41(23):1788-1791.

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