徐麗平，李 佳，房 林

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，根據美國2010年發布的數據，2009年全美女性新發乳腺癌207 090例,高居榜首，遠超過第2位消化系統腫瘤125 790例，乳腺癌死亡共39 840例[1]。2003—2007年我國乳腺癌發病率41.64/10萬，居女性癌癥發病的第1位，死亡率 9.63/10萬，居女性腫瘤死亡率的第6位[2]。因此乳腺癌已成為嚴重威脅全世界女性生命的疾病之一。研究表明微小RNA(microRNAs)是一組非編碼RNA，通過作用于mRNA使其降解或抑制翻譯，調控基因的表達，從而參與細胞的增殖、凋亡、細胞分化、腫瘤的侵襲轉移以及腫瘤干細胞調控等[3-6]。微小RNA-26b(miR-26b)在肝細胞癌、肺癌、乳腺癌和膀胱癌等多種腫瘤中表達異常，其在不同腫瘤中扮演著癌基因或者抑癌基因的角色[7-11]。本研究采用熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測miR-26b在乳腺癌及正常乳腺組織中表達水平，MTT法分析其對于乳腺癌MBA-MD-231細胞增殖的影響，并尋找其可能靶基因。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取上海市同濟大學附屬第十人民醫院甲乳外科2010年1月—2012年5月術后病理確診為乳腺癌的女性患者38例，年齡35～82歲，中位年齡52歲；術前均未行化療、放療及內分泌治療。取乳腺癌組織，并取距離腫瘤組織>5 cm正常乳腺組織作為對照。隨訪時間為行手術治療后至2013年4月，患者術后均接受化療，目前均無復發轉移。人乳腺癌MBA-MD-231細胞株購于中國科學院。

1.2 microRNAs提取和反轉錄 按照Tiangen公司miRcute microRNA提取分離試劑盒說明書進行操作。microRNAs反轉錄參照Chen等[12]的方法，通過特異莖環引物，按照下列順序在PCR試管中加入反應物(體積為8.6 μl)：超純水 2 μl，5×buffer 1.7 μl，microRNAs莖環引物(各個microRNAs及內參U6)1.9 μl，反轉錄酶(Primescript RT Enzyme MixI) 1 μl，microRNAs sample 2 μl。反應條件為：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 8 min，4 ℃ 10 min，反應結束后置于4 ℃冰箱保存。

1.3 實時定量RT-PCR 按照Takara公司SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time) DRR041A說明書完成加樣，反應條件為95 ℃預變性2 min；變性95 ℃ 30 s，退火、延伸60 ℃ 45 s，重復35個循環，70～95 ℃繪制熔解曲線。反應結束后，RQ Manager分析軟件統計處理，獲取Ct值，并根據熔解曲線判斷產物的純度,結果分析根據Livak等[13]的描述，采用半定量分析。

1.4 細胞增殖檢測 按照每孔5 000個細胞的密度將乳腺癌MBA-MD-231細胞種入96孔板。將接種好的96孔板細胞放入培養箱中培養，至細胞單層密度達到50%～60%。分組：采用50、100 nmol/L miR-26b mimics轉染為50 nmol/L組和100 nmol/L組，參照Invitrogen公司lipofectamine說明書完成96孔板細胞轉染；脂質體處理為空對照組，小分子RNA片段轉染組為負對照組。按轉染后24、48、72、96 h 4個時間段分別進行如下操作：每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/L)，繼續培養4 h。吸取上清棄掉，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速震蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值(OD)。

1.5 熒光素酶報告實驗 通過TargetScan軟件尋找miR-26b可能靶基因，前列腺素內過氧化物酶2(PTGS-2)3′UTR存在一個潛在miR-26b靶位結合點(257-264)。以人乳腺癌MBA-MD-231細胞cDNA為模板，按照Primer star kit(Takara)說明書PCR擴增包括miR-26b結合靶點在內的PTGS-2基因部分3′UTR區。PCR引物：正義引物5′-TAGGCGATCGCTCGAGCTGTTGCGGAGAAAGGAGTC-3′，反義引物 5′-AATTCCCGGGCTCGAGTAGTTACTTCTAATGCATCATGG-3′。將目的片段亞克隆到psiCHECK-2質粒上，酶切鑒定和測序分析其正確性。在96孔板中培養人乳腺癌MBA-MD-231細胞，當細胞密度為60%左右時進行轉染，分別轉染psiCHECK-2 PTGS-2 3′-UTR 和100 nmol/L miR-26b mimics(PTGS-2組)，psiCHECK-2/PTGS-2 3′-UTR 突變體 (200 ng) 和 miR-26b (100 nmol/L)(突變體對照組)，200 ng psiCHECK-2空載體和100 nmol/L miR-NC (空載體對照組)，每組設5個復孔。轉染后繼續培養48 h。根據Dual-luciferase report assay system (Promega,USA)說明書完成熒光素酶報告實驗。

1.6 Western blotting 實驗組為100 nmol/L miR-26b mimics轉染組，空對照組為脂質體處理組，負對照組為小分子RNA片段轉染組。轉染后48 h分別收集實驗組和對照組細胞，用預冷的RIPA裂解液裂解后取上清，以Bradford法蛋白定量，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，然后電轉移至硝酸纖維素(NC)膜上，分別加入1∶1 000稀釋的PTGS-2一抗(BioVision,USA)，4 ℃孵育過夜，1∶1 000稀釋的二抗稀釋液中孵育，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜后進行奧德賽系統掃描。

2 結果

2.1 實時定量RT-PCR結果 乳腺癌組織中miR-26b ΔCt為(15.25±0.98)，正常乳腺組織中為(12.37±1.23)，正常乳腺組織中miR-26b表達水平為乳腺癌組織的7.33倍，乳腺癌組織中miR-26b表達低于正常乳腺組織，差異有統計學意義(t=12.21,P=0.007)。

2.2 MTT實驗結果 MTT實驗結果顯示，50 nmol/L組、100 nmol/L組、空對照組和負對照組轉染后24、48 h相對細胞增殖比較，差異均無統計學意義(F值分別為1.314和1.830，P值分別為0.336和0.220)；4組轉染后72、96 h相對細胞增殖比較，差異均有統計學意義(F值分別為11.037和5.470，P值分別為0.003和0.024)；其中轉染后96 h 50 nmol/L組與空對照組比較，差異有統計學意義 (q=-3.048，P=0.038)；轉染后72 h和96 h 100 nmol/L組與空對照組比較，差異均有統計學意義 (q值分別為-3.248和-4.254，P值分別為0.031和0.013,見圖1)。

圖1 不同組乳腺癌MBA-MD-231細胞相對細胞增殖比較

Figure1 Comparison of the proliferation of MBA-MD-231 cancer cells in different groups

2.3 熒光素酶報告實驗 PTGS-2 mRNA在PTGS-2組中ΔCt為(3.91±0.21)，突變體對照組及空載體對照組中分別為(2.25±0.31)、(2.53±0.48)。熒光素酶報告實驗結果顯示，PTGS-2組、突變體對照組及空載體對照組熒光素酶活性比較，差異有統計學意義(F=99.88，P=0.000)；其中PTGS-2組較突變體對照組和空載體對照組均降低，差異有統計學意義(q值分別為-10.314和-12.108，P值分別為0.000和0.000，見圖2)。

圖2 不同組熒光素酶活性比較

Figure2 Comparison of luciferase activities of MBA-MD-231 cancer cells in different groups

2.4 Western blotting結果分析 與空對照組及負對照組相比，實驗組作用乳腺癌MBA-MD-231細胞株48 h后，PTGS-2蛋白的表達量明顯減少(見圖3)。

圖3 不同組PTGS-2蛋白表達情況

Figure3 PTGS-2 protein expression of MBA-MD-231 cancer cells in different groups

3 討論

microRNAs是一類進化上高度保守的單鏈RNA，通常長度在22 nt左右,結合于靶基因mRNA的3′-UTR區域，阻遏翻譯或者直接降解mRNA，抑制基因表達。在腫瘤發生和發展中，miRNA表達譜發生改變，抑制腫瘤的microRNAs表達下調，而促進腫瘤的microRNAs過表達。本實驗發現miR-26b在乳腺癌組織和正常乳腺組織中差異表達，在乳腺癌組織中表達明顯下調,這與在肝癌[7]、鼻咽癌[8]、原發性肺鱗狀細胞癌[9]中的報道相一致。目前的研究表明miR-26b在多種腫瘤中具有多元的作用，如高表達的miR-26b可通過作用于COX-2(cyclooxygenase-2)明顯抑制鼻咽上皮細胞癌細胞的增殖[8]，相反下調垂體腫瘤細胞中miR-26b的表達水平可抑制克隆形成、腫瘤侵襲和小鼠體內成瘤能力[10]。miR-26b通過抑制SLC7A11表達，促進乳腺癌細胞的凋亡，從而參與凋亡的調控過程[11]。本實驗發現miR-26b能夠抑制MBA-MD-231細胞的增殖,這些研究結果表明miR-26b在多種腫瘤的發生和演進中發揮著重要的作用。

PTGS-2催化花生四烯酸向前列腺素(PGs)和其他類花生酸類物質轉化，其在正常組織中含量極少，缺氧、炎性細胞因子、促癌物、生長因子等可誘發其表達[14-15]。PTGS-2參與致癌、免疫反應抑制、細胞凋亡抑制、血管生成、腫瘤細胞的侵襲和轉移等一系列生理病理過程。最近的研究表明，PTGS-2基因變異的女性好發乳腺癌[16-17]，此外，PTGS-2過度表達的乳腺癌患者預后較差[18]。這些研究表明PTGS-2參與腫瘤的形成和發展，其在乳腺癌中扮演著原癌基因的角色。本實驗通過TargetScan預測miR-26b的下游靶基因，發現PTGS-2 3′UTR與miR-26b有著一處潛在的互補結合序列(257-264)，這為PTGS-2是miR-26b可能的靶基因提供了理論依據。熒光定量RT-PCR和Western blotting實驗結果顯示100 nmol/L miR-26b mimics抑制PTGS-2 mRNA和蛋白表達水平，且熒光素酶報告實驗證明miR-26b能夠下調PTGS-2組熒光素酶活性，這從實驗基礎上證明PTGS-2即是miR-26b的靶基因，miR-26b通過作用于PTGS-2基因參與乳腺癌細胞的增殖過程，這與Ji等[8]的報道相一致。

傳統的乳腺癌治療策略，主要包括外科手術、放療、化療和內分泌治療等。microRNAs介導的腫瘤分子治療將是根治腫瘤的重要發展方向。miR-26b在乳腺癌中的表達水平降低，能夠抑制細胞增殖，提示其在乳腺癌中扮演著抑癌基因的角色，因此未來可通過上調miR-26b的表達，實現治療乳腺癌的目的。梅玫等[19]研究發現聚酰胺-胺型樹枝狀高分子(PAMAM)微粒可以實現5氟尿嘧啶(5-Fu)和miR-21的同載，聯合應用5-Fu與miR-21抑制劑可有效抑制乳腺癌細胞的體外生長。因此未來可將5-Fu/PAMAM/miR-26b復合物應用于乳腺癌的臨床治療，這為克服腫瘤提供了新的方向。

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