貴州漢族人群載脂蛋白A5-1131T>C及56C>G基因多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性研究

黃 健，黃韻祝，楊國珍，蹇孝麗

血漿三酰甘油(TG)水平升高是2型糖尿病(T2DM)患者血脂代謝異常的主要特征之一[1-2]。研究表明，人類載脂蛋白A5(ApoA5)基因的單核苷酸突變(SNPs)對人群的TG水平有顯著影響，其中ApoA5-1131T>C及56C>G兩個位點基因多態(tài)性對血漿TG水平的影響較大[3]。由于基因多態(tài)性分布存在種族差異，因此本研究對貴州漢族健康人群及T2DM患者進行ApoA5基因多態(tài)性研究，探討基因多態(tài)性與T2DM的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年3月—2013年3月貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的無親緣關(guān)系的T2DM患者192例為T2DM組，其中男88例，女104例；平均年齡(58.2±10.3)歲，均符合世界衛(wèi)生組織(WHO)1999年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選擇同時期我院體檢中心體檢血脂及血糖正常者206例為對照組，其中男82例，女124例；平均年齡(58.8±9.2)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性炎癥，風(fēng)濕免疫疾病，惡性腫瘤，心腦血管、肝、腎疾病，甲狀腺疾病。兩組均為貴州地區(qū)漢族人群，年齡、性別間有均衡性。

1.2 研究方法

1.2.1 血脂及血糖水平檢測 采用生化管抽取受試者清晨空腹外周血5 ml，離心半徑13.5 cm，3 000 r/min離心5 min,取上層血清使用奧林巴斯5400全自動生化分析儀測定TG、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)及血糖水平。

1.2.2 外周血基因組DNA提取 抽取外周靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝用于提取基因組DNA。按亞能生物技術(shù)有限公司DNA提取試劑盒說明書抽提基因組DNA。取5 μl基因組DNA與1 μl 6×loading buffer點樣，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，90 V電壓電泳60 min。在凝膠成像儀上觀察所提取的基因組DNA的亮度及純度(此試劑盒提取的DNA在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳有一條清晰的約20 kbp的DNA條帶)。

1.2.3 ApoA5-1131T>C、56C>G位點的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析 (1) 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增：引物設(shè)計參考相關(guān)文獻[4]設(shè)計如下：-1131T>C位點上游5′GGAGCTTGTGAACGTGTGTATGAGT 3′,下游5′CCCCAGGAACTGGAGCGAAATT 3′。56C>G位點上游5′GGCTCTTCTTTCAGGTGGGTCTCCG 3′，下游5′GCCTTTCCGTGCCTGGGTGGT 3′。由寶生物工程有限公司合成。PCR擴增反應(yīng)體系(25 μl)：包括Premix Taq 12.5 μl，模板DNA 3 μl，上下引物各0.3 μl，雙蒸水補足體積。PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，59 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物5 μl用2%的瓊脂糖凝膠中電泳(90 V 40 min)，在凝膠成像儀上觀察并攝像，結(jié)合DNA Marker判斷是否為目的DNA。(2) ApoA5-1131T>C位點PCR產(chǎn)物酶切：取出現(xiàn)清晰的特異性條帶PCR產(chǎn)物，以MseⅠ限制性內(nèi)切酶進行消化(37 ℃水浴4 h)。酶切反應(yīng)體系如下(20 μl)：10×Buffer 2 μl，牛血清清蛋白(BSA)0.2 μl，MseⅠ0.5 μl，PCR產(chǎn)物8 μl，雙蒸水補足體積。酶切產(chǎn)物用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，80 V電壓電泳2 h，在凝膠成像儀上觀察并攝像。(3) 56C>G位點PCR產(chǎn)物酶切：取出現(xiàn)清晰的特異性條帶PCR產(chǎn)物，以TaqⅠ限制性內(nèi)切酶進行消化(65 ℃水浴2 h)。酶切反應(yīng)體系如下(10 μl)：10×Buffer 1 μl，BSA 1 μl，TaqⅠ0.5 μl，PCR產(chǎn)物8 μl，雙蒸水補足體積。酶切產(chǎn)物用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，80 V電壓電泳2 h，在凝膠成像儀上觀察并攝像。

2 結(jié)果

2.1 ApoA5-1131T>C、56C>G位點PCR酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果 -1131T>C位點位于ApoA5基因啟動子區(qū)域，酶切產(chǎn)物電泳后可出現(xiàn)3種情況：133 bp和21 bp兩條帶的為TT野生型純合子；只有154 bp一條帶的為CC突變型純合子；有154 bp、133 bp和21 bp三條帶的為TC型雜合子(見圖1)。

56C>G位點酶切產(chǎn)物有三種基因型：134 bp和23 bp兩條帶的為CC野生型純合子；只有157 bp一條帶的為GG突變型純合子；有157 bp、134 bp和23 bp三條帶的為CG型雜合子(見圖2)。

2.2 對照組與T2DM組ApoA5-1131T>C基因型和等位基因頻率分布比較 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，對照組(χ2=0.477，P=0.489)、T2DM組(χ2=1.597，P=0.206)ApoA5-1131T>C基因型分布均符合遺傳平衡定律，具有群體代表性。兩組的基因型和等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相對風(fēng)險顯示攜帶TC+CC基因型者患T2DM的風(fēng)險是TT基因型的1.965倍(見表1)。

2.3 對照組及T2DM組ApoA5-1131T>C位點不同基因型者血脂水平比較 對照組TC+CC基因型攜帶者TG水平高于TT基因型攜帶者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；T2DM組TC+CC基因型攜帶者TG水平高于TT基因型攜帶者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而對照組和T2DM組TC+CC基因型攜帶者與TT基因型攜帶者TC、LDL、HDL水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2、3)。

圖1 ApoA5-1131T>C位點限制性片段長度多態(tài)性分析

Figure1 Genotyping of the T>C polymorphism at nucleotide -1131 of the ApoA5 gene by PCR-RFLP

2.4 ApoA5 56C>G位點基因型及等位基因頻率分布情況分析 ApoA5 56C>G位點位于ApoA5基因第二外顯子，PCR產(chǎn)物長度157 bp。僅檢測出CC一種基因型，沒有發(fā)現(xiàn)其他基因型，無法進行統(tǒng)計學(xué)分析，也無法分析這一位點與T2DM及血脂的關(guān)系，因此未做進一步的探討。

圖2 ApoA556C>G位點限制性片段長度多態(tài)性分析

Figure2 Genotyping of the C>G polymorphism at nucleotide 56 of the ApoA5 gene by PCR-RFLP

表1 對照組與T2DM組ApoA5-1131T>C基因型和等位基因頻率分布比較〔n(%)〕

Table1 Comparison of distributions of ApoA5-1131T>C genotype and allele between control group and T2DM group

組別例數(shù)基因型TT TC CC等位基因T C對照組206108(524)85(413)13(63)301(731)111(269)T2DM組19269(359)99(516)24(125)237(617)147(383)χ2值1245211666P值 0002 0001 OR值 1965 1682 95%CI(1314，2937)(1247，2269)

Table2 Comparison of lipoprotein levels in ApoA5-1131T>C defferent genotype in control group

基因型例數(shù)TGTCLDLHDLTT108156±054468±101304±070128±025TC+CC 98 184±087452±124313±065135±030t值-26851064-0870-1911P值 00080289 0386 0058

注：TG=三酰甘油，TC=總膽固醇，LDL=低密度脂蛋白，HDL=高密度脂蛋白

Table3 Comparison of lipoprotein levels in ApoA5-1131T>C defferent genotype in T2DM group

基因型例數(shù)TGTCLDLHDLTT 69 164±058419±118248±085115±031TC+CC123231±145446±128256±085107±029t值-4472-1516-06131841P值 0000 0132 05410067

3 討論

糖尿病是目前世界范圍內(nèi)繼腫瘤、心腦血管病后的第三位嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病。糖尿病患者脂代謝紊亂一直是人們關(guān)注的重點,其重要作用越來越受到人們的重視[5]。ApoA5基因是新近發(fā)現(xiàn)的一個載脂蛋白基因，研究表明，人類ApoA5基因的SNPs對人群的TG水平有顯著影響，而ApoA5調(diào)節(jié)TG的作用機制目前仍在研究當(dāng)中[6-7]。很多患者在糖代謝異常之前就已經(jīng)出現(xiàn)了脂代謝異常，血TG水平升高是其常見特點。Sane等[8]對6個家族性高三酰甘油血癥(HTG)家系患者進行追蹤，發(fā)現(xiàn)這類家系中T2DM的發(fā)病率明顯增加，認(rèn)為空腹血TG水平增高是發(fā)生T2DM的獨立預(yù)測指標(biāo)。Chiu等[9]發(fā)現(xiàn)，ApoA5基因多態(tài)性對胰島β細(xì)胞功能可構(gòu)成影響，從而影響血糖的調(diào)節(jié)，其作用機制可能為：ApoA5與肝素結(jié)合細(xì)胞因子(midkine)相關(guān)聯(lián)，進而促進胰島β細(xì)胞對胰島素的分泌。

本研究發(fā)現(xiàn)T2DM組的TC基因型頻率高于對照組，-1131C等位基因攜帶者(TC+CC)的TG水平高于未攜帶者(TT)，C等位基因攜帶者(TC、CC)的TG水平高于未攜帶者(TT),此結(jié)果與國內(nèi)的一些研究結(jié)果相似[10]。但肖輝等[11]對ApoA5-1131T>C基因多態(tài)性與維吾爾族T2DM的關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，ApoA5-1131C基因多態(tài)性與新疆維吾爾族的T2DM的發(fā)生并不具有相關(guān)性，可能因研究對象的差異及不同地區(qū)人群的遺傳背景不同所致。要揭示其更加具體的關(guān)系尚有待更大樣本量的臨床研究以及基礎(chǔ)研究。對ApoA5-1131T>C基因多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)，不同種族人群的-1131C等位基因頻率有差異。本研究顯示貴州地區(qū)漢族人群的ApoA5基因-1131C等位基因頻率與亞洲人相似，高于白種人，這與國內(nèi)的一些研究結(jié)果相似[12-13]。說明C等位基因在亞洲人群中更為常見，提示該基因的變異對血TG水平的影響在亞洲人中可能更值得注意。ApoA5-1131T>C位點在不同種族人群當(dāng)中可以不同程度地影響人血漿TG水平，而對TC、LDL-C、HDL-C等的影響卻沒有統(tǒng)一的認(rèn)識，原因或許是由于遺傳背景、觀察手段、樣本特征等這些因素造成的。

在進行ApoA5 56C>G基因多態(tài)性研究中，只檢測出CC一種基因型，所以無法建立血脂水平與這個位點之間的關(guān)系。其可能原因是由于遺傳背景的差異使得中國人血脂變化對其不敏感，或是因為樣本數(shù)量不夠大導(dǎo)致應(yīng)該存在的差異未顯露出來。丁妍等[14]在對257名湖北省漢族人群56C>G位點研究中

得出G等位基因頻率小于1%，其認(rèn)為ApoA5基因 56C>G是一個突變點而不是一個多態(tài)位點。而Huback等[15]研究發(fā)現(xiàn)這個位點的突變不僅使TG水平升高，還增加了患急性心肌梗死的風(fēng)險。這說明在不同人種之間遺傳背景差異很大。因此研究不同民族之間的這種差異，有助于解釋不同人群和個體對疾病的易患性。由于本次實驗的樣本量較少，這個位點到底是突變點還是多態(tài)位點需要加大樣本量再做進一步的證實。

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15 Huback JA,Skodova Z,Adamkova V,et al.The influence of APOAV polymorphisms(T-1131>C and S19>W) on plasma triglyceride levels and risk of myocardial infarction[J].Clin Genet,2004,65(2):126-130.