促甲狀腺激素受體基因甲基化與甲狀腺乳頭狀癌關聯的Meta分析

張 晨，霍 倩，李翠珍，周志俊，吳 慶

甲狀腺癌是一種最常見的內分泌系統腫瘤，甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最普遍的甲狀腺腫瘤組織類型，占甲狀腺癌的59.9%～89.0%，其病因機制復雜，發病率高[1]。促甲狀腺激素受體(thyroid stimulating hormone receptor，TSHR)基因的表達在甲狀腺癌中起著重要的作用[2]。促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)通過與TSHR結合發揮作用，激活2條主要的信號轉導途徑：腺苷酸環化酶-蛋白激酶途徑和磷脂酶c-蛋白激酶c通路。甲狀腺細胞表面表達的TSHR與TSH結合，可以上調鈉/碘協同轉運體(Na+/I-symporter，NIS)的表達[3]，發揮對碘代謝功能的調節作用。如果甲狀腺中TSHR表達缺失或功能異常，就會造成甲狀腺攝取、濃縮和利用碘的功能異常[4-5]。而TSHR基因的高甲基化會影響其基因的表達，并在甲狀腺乳頭狀腫瘤的形成與預后中起重要作用[6]。目前對于表觀遺傳在甲狀腺腫瘤中的作用研究較少，本研究利用Meta分析方法研究TSHR基因的甲基化與甲狀腺乳頭狀癌之間的關系，為預防和診治甲狀腺乳頭狀癌提供參考。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索策略 本研究以檢索詞(DNA OR TSHR OR thyroid stimulating hormone receptor)AND (thyroid OR papillary thyroid) AND (carcinoma OR cancer OR neoplasm OR tumor) AND (methylation OR epigenetic)計算機檢索Medline、Web of science、Cochrane Central、Ovid英文數據庫，檢索范圍為2000年1月—2013年4月。同時以“甲狀腺乳頭狀癌”或“甲狀腺乳頭狀腫瘤”和“TSHR”為檢索詞計算機檢索中國學術期刊全文數據庫、萬方、維普數據庫，檢索范圍為2000年1月—2013年4月。同時輔以文獻追溯和手工檢索等，收集各種雜志公開發表的學術論文、學位論文和會議摘要等。

1.2 文獻納入與排除標準 兩名獨立檢索人員根據以下標準篩選和納入文獻：(1)文獻研究方法均為流行病學研究，并分析TSHR基因甲基化與甲狀腺乳頭狀癌的關系。(2)TSHR基因甲基化的檢測方法為甲基化特異性聚合酶鏈反應(methylation specific PCR，MSP)、實時熒光定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative methylation specific PCR，QMSP)或聯合亞硫酸氫鈉限制性內切酶分析法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)。(3)所有納入文獻均有全文可供數據提取。(4)在每個研究中均有病例與對照。(5)如果是相同的病例人群在不同雜志發表，只納入其中最新或最完整的報道，避免提取重復數據。(6)每個研究的病例與對照人數均不少于3人。以下類型的研究被排除在外：動物實驗，案例報告，回顧薈萃分析，重復論文，綜述以及數據不足。相應的文獻被進一步檢索來確認是否符合納入標準，檢索不一致的地方通過兩位檢索人員討論并解決。

1.3 數據收集與質量評價方法 檢索收集信息包括第一作者的名稱，出版的時間，研究的樣本來源、大小，甲狀腺乳頭狀癌和正常或對照組織中的TSHR基因甲基化水平，年齡分布，腫瘤分級，以及是否存在淋巴結轉移。對于對照選擇有三種定義：(1)正常的健康人群；(2)患有甲狀腺疾病但未患有甲狀腺惡性腫瘤的患者；(3)甲狀腺乳頭狀癌患者的癌旁組織。根據紐卡斯卡-渥太華質量評價量表(Newcastle-Ottawa scale，NOS)評價納入研究的偏倚風險，選擇其中病例-對照研究量表，評價內容包括研究對象選擇、可比性和暴露3個方面，共9分。同時基于Meta分析的結果，應用推薦分級的評價、制定與評估(grades of recommendations assessment，development and evaluation，GRADE)系統推薦分級方法[7]和GRADE profiler (version 3.6)軟件評價納入文獻的總體質量及推薦等級，分級為：(1)高質量：我們非常確信真實的效應值接近效應估計值；(2)中等質量：我們對效應估計值有中等程度的信心：真實值有可能接近估計值，但仍存在二者大不相同的可能性；(3)低質量：我們對效應估計值的確信程度有限：真實值可能與估計值大不相符；(4)極低質量：我們對效應估計值幾乎沒有信心：真實值很可能與估計值大不相同。

1.4 統計學方法 采用STATA軟件(Stata/SE 11.0 for Windows，StataCorp LP)用于統計分析。使用異質性檢驗，如果其研究間I2>50%，以及χ2檢驗(P≤0.05)都認為納入的研究存在異質性，運用 DerSimonian-Laird 隨機效應模型[8]進行數據合并；反之則認為不存在異質性，運用Mantel-Haenszel固定效應模型[8]進行數據合并，關聯強度用合并OR值和95%CI表示，并計算不同研究間變異。τ2值表示有多大的異質性是可以被亞組之間的差異所解釋[9]。Meta回歸分析用于解釋異質性的來源。病例組和對照組中TSHR基因甲基化水平的OR通過分成不同亞組進行分析，包括人群來源(中國和國外)、對照類型(自體組織和其他人群組織)、年齡分層(<45歲和≥45歲)、腫瘤TNM分期(早期和中晚期)以及是否有淋巴結轉移。敏感度分析用于評價每個研究在最終結果中的貢獻度，漏斗圖以及Egger檢驗分析其發表偏倚。

2 結果

2.1 文獻檢索結果 使用文獻檢索詞，共檢索到214篇相關文獻，進一步通過納入標準進行篩選，總共13篇文獻被挑選出來，通過閱讀分析全文，5篇文獻予以排除(見圖1)。剩余8篇文章[2，4，5，10-14]被合并分析TSHR基因甲基化與甲狀腺乳頭狀癌的風險關系(見表1)，得到的總樣本量為583份，其中甲狀腺癌組織樣本為342份，對照組樣本為241份；來自中國的研究為4篇，美國2篇，伊朗1篇，德國1篇；甲基化檢測方法主要有MSP、QMSP和COBRA。在隨機效應模型中，甲狀腺乳頭狀癌樣本中TSHR基因發生甲基化數與對照組相比的合并OR值為4.57〔95%CI(1.68，12.43)，z=2.98，P<0.01，見圖2〕。本研究GRADE系統評價推薦分級為中等質量，推薦強度為中級。

表1 研究的基本情況

注：M+：樣本中甲基化數量，M-：樣本中未甲基化數量；A：同源對照(autologous control)，對照樣本來源患者自體癌旁組織；H：異質對照(heterogeneous control)，對照樣本來源其他人群正常組織；MSP：甲基化特異性聚合酶鏈反應；QMSP：實時熒光定量甲基化特異性聚合酶鏈反應；COBRA：聯合亞硫酸氫鈉限制性內切酶分析法；NOS：紐卡斯卡-渥太華質量評價量表(Newcastle-Ottawa scale)

圖1 文獻納入流程圖

圖2 納入研究的森林圖

2.2 分層分析和Meta回歸 表2展示了用不同分層進行Meta分析的結果。在不同對照類型的分層分析中，對照為其他人群組織〔OR=8.51，95%CI(3.72，19.46)〕的甲狀腺乳頭狀癌樣本中TSHR基因甲基化發生的風險明顯高于自體對照樣本〔OR=3.09，95%CI(0.67，14.27)〕。通過人群來源分層時，中國人群〔OR=9.18，95%CI(5.19，16.23)〕甲狀腺乳頭狀癌中甲基化發生的風險明顯高于國外〔OR=1.99，95%CI(0.30，13.16)〕。在年齡分層分析中發現，年齡<45歲的人群〔OR=9.18，95%CI(5.19，16.23)〕相比年齡≥45歲的人群〔OR=1.11，95%CI(0.17，7.20)〕，其TSHR基因甲基化發生風險較高。在TNM不同分期時對甲基化發生風險進行評價，TNM Ⅰ～Ⅱ期為甲狀腺乳頭狀癌早期階段，Ⅲ～Ⅳ期為中晚期階段，TSHR基因甲基化發生風險在中晚期階段〔OR=14.12，95%CI(2.93，68.18)〕明顯高于早期〔OR=6.01，95%CI(3.21，11.28)〕。對是否有淋巴結轉移進行分析，有淋巴結轉移的甲狀腺乳頭狀癌樣本〔OR=14.29，95%CI(2.47，82.75)〕甲基化發生風險也明顯高于未觀察到淋巴結轉移的樣本〔OR=5.85，95%CI(3.15，10.85)〕。

由于本研究存在異質性(I2=72.7%，χ2=25.65，P<0.01)，因此進行Meta回歸分析(Knapp-Hartung修正)，研究間的殘差用τ2來表示，使用限制性最大似然比法來估計研究間的變異程度。Meta回歸分析的結果表明，樣本量的差異與異質性呈負相關(Coefficient=0.04，P<0.05，AdjustedR2=66.78%，見表3)，而其他因素諸如：男性比例、年齡、出版年份、對照類型、人群來源均與研究的異質性無關。

2.3 敏感性分析與發表偏倚 敏感性分析表明有一項研究[5]可能是異質性的主要來源(見表4)，當把這項研究移除后，在甲狀腺乳頭狀癌人群中TSHR基因甲基化的發生風險與對照相比異質性明顯降低(χ2=8.91，P=0.179,I2=32.7%)。除此之外，并沒有其他單項研究能夠影響合并后的OR值。通過繪制漏斗圖，研究大致呈對稱漏斗分布(見圖3)，同時Egger檢驗(t=-0.01，P>0.05)也表明此次納入對象不存在發表偏倚，納入的文章質量良好。

表2 促甲狀腺激素受體基因甲基化與甲狀腺乳頭狀癌發生風險的分層分析

表3 Meta回歸分析

表4 異質性分析

3 討論

甲狀腺癌是內分泌系統最常見的惡性腫瘤，甲狀腺乳頭狀癌最為常見，其發病率較高，其發生、發展是包括癌基因的激活和抑癌基因失活等多因素、多步驟的復雜過程，目前普遍認為DNA的甲基化是導致抑癌基因失活的重要機制[15-16]。TSHR是甲狀腺細胞的一種特異性蛋白質，主要分布于甲狀腺濾泡上皮細胞膜上，其主要功能是與TSH結合，通過刺激甲狀腺聚集碘全面調節甲狀腺功能。然而，對于TSHR基因的甲基化在人甲狀腺乳頭狀癌中的作用目前尚未統一[6，17]，TSHR表達異常以及其甲基化發生率的提高與許多甲狀腺癌發病風險之間的聯系仍在探索中[3，18]。因此本研究通過Meta分析對TSHR基因的甲基化與人甲狀腺乳頭狀癌的發生風險進行系統綜合的評價。

圖3 發表偏倚的漏斗圖

為了進一步驗證TSHR基因甲基化狀態與人甲狀腺乳頭狀癌發生之間的風險，本研究綜合了342份病例以及241份對照進行Meta分析，結果表明甲狀腺乳頭狀癌樣本中TSHR基因的甲基化明顯高于對照組，是可能的危險因素。分層分析中，TSHR基因的甲基化在中國人群中以及年齡<45歲的人群中也是潛在的甲狀腺乳頭狀癌危險信號，其甲基化發生頻率是對照組的9.18倍，并且在Meta回歸中，年齡的回歸系數為-0.13，呈現負相關。以往研究也表明，甲狀腺癌發病高危人群為青壯年，平均年齡為40歲，之后發病率有所下降[19-20]，但在中老年人群中甲狀腺癌的預后很差[21-22]。這與本研究結果較符，因此TSHR基因甲基化也許能夠作為一個獨立的分子標志物對中國特定年齡人群的甲狀腺乳頭狀癌進行篩查。

TSHR基因的甲基化發生率與人甲狀腺乳頭狀癌的TNM臨床分期，以及是否存在淋巴結轉移都有密切聯系[2，10]，但其研究結果卻存在爭議[14，23]。通過Meta分析表明，TSHR基因甲基化的發生在甲狀腺乳頭狀癌早期已經存在，并貫穿于整個甲狀腺乳頭狀癌的進展過程中。在甲狀腺乳頭狀癌的中晚期以及淋巴結轉移的人群中，其TSHR基因甲基化風險明顯增加，與其早期階段比較差異有統計學意義。本研究表明TSHR基因甲基化不僅在甲狀腺乳頭狀癌早期診斷中具有重要意義，而且對甲狀腺乳頭狀癌中晚期不良預后以及淋巴結轉移有指示作用。

還需要指出的是，本次研究仍然存在著一些局限性，首先研究所納入的8篇中英文文獻均為病例對照研究，并且樣本量較小，這與甲基化水平檢測的技術要求以及研究費用較高有關。其次一些影響因素，如生活方式、性別、遺傳因素并未納入研究中予以分析，這為以后研究提供了方向。

1 Sherman SI.Thyroid carcinoma[J].Lancet,2003,361(9356):501-511.

2 許敬，葛明華，凌志強，等.甲狀腺乳頭狀癌中TSHR基因啟動子區5′-CpG島甲基化研究[J].腫瘤，2010，30(8)：696-699.

3 Garcia-Jimenez C,Santisteban P.TSH signalling and cancer[J].Arq Bras Endocrinol Metabol,2007,51(5):654-671.

4 Smith JA,Fan CY,Zou C,et al.Methylation status of genes in papillary thyroid carcinoma[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2007,133(10):1006-1011.

5 Mohammadi-asl J,Larijani B,Khorgami Z,et al.Qualitative and quantitative promoter hypermethylation patterns of the P16,TSHR,RASSF1A and RARbeta2 genes in papillary thyroid carcinoma[J].Med Oncol,2011,28(4):1123-1128.

6 Eze OP,Starker LF,Carling T.The role of epigenetic alterations in papillary thyroid carcinogenesis[J].J Thyroid Res,2011,2011:895470.

7 Guyatt GH,Oxman AD,Vist GE,et al.GRADE:An emerging consensus on rating quality of evidence and strength of recommendations[J].BMJ,2008,336(7650):924-926.

8 DerSimonian R,Laird N.Meta-analysis in clinical trials[J].Control Clin Trials,1986,7(3):177-188.

9 The Cochrane Collaboration.Cochrane Handbook for Systematic Reviews of Interventions Version 5.1.0[EB/OL].http://www.cochrane-handbook.org.

10 唐建東，栗夏蓮.甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR基因啟動子甲基化研究[J].中華現代內科學雜志，2009，6(5)：321-325.

11 Dai YL,Cai DH,Chen H,et al.Transcription and promoter hypermethylation of thyroid stimulating hormone receptor gene in human papillary thyroid carcinoma[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao,2010,30(1):114-117.

12 Xing M,Usadel H,Cohen Y,et al.Methylation of the thyroid-stimulating hormone receptor gene in epithelial thyroid tumors:A marker of malignancy and a cause of gene silencing[J].Cancer Res,2003,63(9):2316-2321.

13 Schagdarsurengin U,Gimm O,Dralle H,et al.CpG island methylation of tumor-related promoters occurs preferentially in undifferentiated carcinoma[J].Thyroid,2006,16(7):633-642.

14 史曉光，滕衛平，成建新，等.甲狀腺乳頭狀癌中TSHR NIS基因甲基化和蛋白表達及其與BRAF突變的關系[J].中國醫科大學學報，2009，38(6)：401-404.

15 樊嘉，邱雙健.腫瘤微環境的研究動態與展望[J].中華醫學雜志，2008，88(8)：505-507.

16 黃韜.ATA、NCCN及歐洲分化型甲狀腺癌臨床指南異同點和國內應用探討[J].中國實用外科雜志，2011，31(5)：407-410.

17 Stephen JK,Chitale D,Narra V,et al.DNA methylation in thyroid tumorigenesis[J].Cancers (Basel),2011,3(2):1732-1743.

18 Xing M.Gene methylation in thyroid tumorigenesis[J].Endocrinology,2007,148(3):948-953.

19 Albores-Saavedra J,Henson DE,Glazer E,et al.Changing patterns in the incidence and survival of thyroid cancer with follicular phenotype——papillary,follicular,and anaplastic:A morphological and epidemiological study[J].Endocr Pathol,2007,18(1):1-7.

20 朱衛東，王鑫.甲狀腺乳頭狀癌21例治療分析[J].河北醫藥，2010,32(8)：978.

21 Wada N,Masudo K,Nakayama H,et al.Clinical outcomes in older or younger patients with papillary thyroid carcinoma:Impact of lymphadenopathy and patient age[J].Eur J Surg Oncol,2008,34(2):202-207.

22 王勇，郭淑琴，程曉東.TGF-β1和CD31在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及臨床意義[J].河北醫藥，2011,33(10)：1477.

23 戴亞麗，蔡德鴻，宏陳，等.促進甲狀腺激素受體和pl6抑癌基因甲基化與乳頭狀甲狀腺癌臨床病理的關系[J].首都醫科大學學報，2012，33(3)：361-365.