PRODH-1945(T/C)基因多態性與廣西壯族和漢族精神分裂癥易感性的關聯性研究

龍建雄，蘇 莉，韋 波，陳 強，馮啟明，潘潤德，唐海寧，李柳姍，張海英，農清清

精神分裂癥(Schizophrenia)是嚴重危害人類生命健康的精神疾病，終生患病率約為1%[1]。既往研究證明其遺傳度高達80%以上[2]，但其遺傳機制目前尚未完全明了。染色體22q11缺失攜帶者可能出現神經發育、認知、行為和精神等異常的風險是普通人群的數倍，既往多個相互獨立的連鎖研究報道均提示在22號染色體長臂可能存在與精神分裂癥連鎖的易感位點[3]。脯氨酸脫氫酶(proline dehydrogenase,PRODH)基因位于染色體22q11缺失區，被認為是精神分裂癥的位置候選基因。PRODH基因編碼的脯氨酸脫氫酶是一種線粒體酶，能促進L-脯氨酸的新陳代謝， L-脯氨酸直接影響谷氨酸介導的神經傳遞，而谷氨酸系統缺陷假說一直是精神分裂癥的重要病因假說之一[4]，故PRODH基因也是備受關注的精神分裂癥功能候選基因。既往有關PRODH基因多態性與精神分裂癥的關聯性研究結果并不一致[5-6]。為此，本研究對282例壯族、漢族精神分裂癥患者和282例壯族、漢族健康對照者，采用TaqMan MGB探針等位基因分型技術對PRODH-1945(T/C)多態性(即rs372055)進行基因分析，探討該位點與廣西壯族、漢族精神分裂癥易感性的關聯性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 病例組 包括壯族病例組和漢族病例組，納入與排除標準如下：(1)納入標準：①所有患者經至少兩名副主任醫師以上職稱的精神科專科醫師根據國際疾病及相關健康問題分類第10版(ICD-10)精神與行為障礙分類臨床描述與診斷要點確診為精神分裂癥患者，并對實施診斷的醫師經過嚴格培訓，進行診斷一致性檢驗，保證入組對象的同質性；②患者自我(或其直系家屬)報告患者三代內均為本民族血緣；③患者自我(或其直系家屬)報告患者籍貫為廣西人。(2)排除標準：①存在各種腦器質性疾病或軀體性疾病所致精神障礙，或由于藥物、治療所致的精神障礙；②合并腦卒中、癲癇等神經系統疾病或其他嚴重的軀體性疾??；③精神發育遲滯者；④有嚴重腦創傷史者；⑤具有物質濫用(包括藥物濫用和乙醇濫用)史者；⑥因嚴重興奮、沖動不配合者，或者有嚴重自殺、自傷傾向者。壯族病例組共納入94例患者，漢族病例組共納入188例患者，入選患者均為2010年4月—2010年6月廣西壯族自治區腦科醫院收治的精神分裂癥住院患者。

1.1.2 對照組 包括壯族對照組和漢族對照組，納入與排除標準如下：(1)納入標準：①健康正常人；②患者自我報告三代內均為本民族血緣；③自我報告籍貫為廣西人。(2)排除標準： ①既往具有精神疾病病史或者精神疾病家族史者；②具有神經系統疾病病史或家族史者；③具有嚴重軀體疾病者；④具有嚴重家族性遺傳病史者；⑤有嚴重的頭部創傷史或產傷史者。共納入壯族對照94例，其中30例為2010年7月—2010年12月在廣西中醫學院第一附屬醫院體檢中心體檢的壯族健康體檢者，64例為2011年1月在廣西柳江縣(壯族聚居縣)招募的壯族健康志愿者。共納入漢族對照188例，均為2010年7月—2010年12月在廣西中醫學院第一附屬醫院體檢中心體檢的漢族健康體檢者。由經過統一培訓的調查員，在納入對照前采用自編調查表與受試者進行簡短會談，然后根據受試者自我報告情況，按照納入和排除標準納入合格對照。

上述564例受試者之間均無上代族間通婚史，也無親緣關系。所有患者或其家屬/法定監護人及健康對照者在入組前詳細了解本研究的目的和程序，并取得其本人或患者家屬/法定監護人的知情同意。

1.2 基因分型 采集每例受試者的外周靜脈血5 ml，置于含有EDTA抗凝劑的真空采血管內，混勻， 4 ℃保存，并于3 d內提取基因組DNA。采用天根科技(北京)有限公司生產的血液基因組DNA提取試劑盒〔TIANamp Blood DNA Kit(離心柱形),目錄號DP318DNA〕,血液基因組DNA的提取嚴格按照產品說明書操作。DNA提取后分裝為3管，置于-80 ℃冰箱保存備用。采用TaqMan MGB探針等位基因分型技術對PRODH-1945(T/C)進行基因分型。使用美國應用生物系統(ABI) 公司生產的ABI7500 Fast 實時熒光定量PCR儀、TaqMan SNP基因分型試劑盒〔試劑盒內含2×通用PCR預混試劑Universal PCR Master mix (無AmpErase UNG酶),40×SNP 基因分型試劑Genotyping Assay Mix〕。PCR反應體系的總體積為10 μl，包含：2×TaqMan Universal PCR Mix 5.00 μl；Assay-on-Demand SNP Genotyping Assay Mix(40×) 0.25 μl；無核酸H2O 3.75 μl；基因組DNA 1.00 μl。PCR反應條件：預變性95 ℃10 min，變性92 ℃15 s、退火60 ℃1 min，變性及退火程序循環43次。采取以下措施進行實驗操作質量控制：對實驗操作者設盲，使操作者在進行基因分型時不知道標本的病例/對照狀態；每次96 孔PCR反應板均設置2個空白對照和3個隨機重復樣本作為陽性對照；并隨機抽取總樣本中5% 的樣本進行盲法重復測定,檢測結果一致率為100%。

2 結果

2.1 研究對象的人口學特征 在壯族樣本中，病例組和對照組受試者的性別構成、年齡間差異無統計學意義(P>0.05)；在漢族樣本中，病例組和對照組受試者的性別構成、年齡間差異亦均無統計學意義(P>0.05)；在總樣本中，病例組和對照組受試者的性別構成、年齡間差異亦無統計學意義(P>0.05，見表1、表2)。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗 擬和優度χ2檢驗結果顯示，PRODH-1945(T/C)基因型在壯族、漢族對照組中的頻數分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，說明本研究所應用的抽樣群體適合于遺傳分析(見表3)。

2.3PRODH-1945(T/C)與壯族、漢族精神分裂癥易感性的關聯 在壯族、漢族樣本中，病例組與對照組的PRODH-1945(T/C)基因型頻率、等位基因頻率的分布差異均無統計學意義(P>0.05)；由于壯族病例組與漢族病例組PRODH-1945(T/C)基因型頻率(χ2=0.316，P=0.854)、等位基因頻率(χ2=0.206,P=0.650)的分布差異無統計學意義，壯族對照組與漢族對照組PRODH-1945(T/C)基因型頻率(χ2=0.872，P=0.648)、等位基因頻率(χ2=0.485,P=0.486)的分布差異也無統計學意義,故分別將兩個民族的病例組、對照組合并作為總樣本病例組、總樣本對照組，在總樣本中，病例組與對照組PRODH-1945(T/C)基因型頻率、等位基因頻率的分布差異亦無統計學意義(P>0.05，見表4、表5)。

表1 病例組與對照組受試者的性別構成比較

Table1 Comparison of gender between schizophrenia patients and normal controls

組別例數性別〔n(%)〕男 女χ2值P值壯族病例組 94 60(63.8)34(36.2)1.4130.234對照組 94 52(55.3)42(44.7)漢族病例組188119(63.3)69(36.7)0.1020.749對照組188116(61.7)72(38.3)總樣本病例組282179(63.5)103(36.5)0.9060.341對照組282168(59.6)114(40.4)

表2 病例組與對照組受試者的年齡比較

Table2 Comparison of age between schizophrenia patients and normal controls

組組例數年齡(x±s,歲)t值P值壯族病例組 94 32.0±12.00.6130.542對照組 94 33.0±9.6漢族病例組18833.9±12.30.0740.941對照組18833.8±8.2總樣本病例組28233.2±12.20.3020.763對照組28233.5±8.7

表3 對照組樣本Hardy-Weinberg平衡的擬和優度χ2檢驗

Table3 The χ2goodness-of-fit test of Hardy-Weinberg equilibrium in normal controls

分組實際頻數T/T T/C C/C預計頻數T/T T/C C/Cχ2值P值壯族對照 65 272 66 2620.1730.677漢族對照1255581245770.3810.537

表4 病例組與對照組受試者PRODH-1945(T/C)基因型頻率分布比較〔n(%)〕

Table4 Comparison ofPRODH-1945 (T/C) genotype frequency between schizophrenia patients and normal controls

組別例數基因型頻率〔n(%)〕T/T T/C C/Cχ2值P值壯族病例組94 62(65.95) 30(31.92) 2(2.13) 0.2290.892對照組94 65(69.15) 27(28.72) 2(2.13) 漢族病例組188120(63.83)62(32.98) 6(3.19) 0.8070.668對照組188125(66.48)55(29.26) 8(4.26) 總樣本病例組282182(64.64)92(32.62) 8(2.84) 0.9690.616對照組282190(67.38)82(29.08)10(3.54)

表5 病例組與對照組受試者PRODH-1945(T/C)等位基因頻率分布比較

Table5 Comparison ofPRODH-1945 (T/C) allele frequency between schizophrenia patients and normal controls

組別例數等位基因頻率〔n(%)〕T Cχ2值P值壯族病例組 94 154(81.91) 34(18.09) 0.1670.682對照組 94 157(83.51) 31(16.49) 漢族病例組188302(80.32) 74(19.68) 0.0770.781對照組188305(81.12) 71(18.88) 總樣本病例組282456(80.85)108(19.15)0.2110.646對照組282462(81.91)102(18.09)

3 討論

本研究在分子流行病學的水平上，進行了PRODH-1945(T/C)基因多態性(即rs372055)與廣西壯族、漢族精神分裂癥易感性的關聯研究。為降低遺傳異質性的影響，本研究選擇純民族血緣人群作為研究對象，納入祖籍廣西而且三代之內都是壯族或三代之內都是漢族血緣的樣本人群。PRODH-1945(T/C)基因型在壯族、漢族對照組中的頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示本研究樣本來自大的隨機婚配群體，沒有突變、選擇、遷移和遺傳漂變等進化過程對遺傳平衡的影響，能夠代表各自群體的客觀情況，適合于遺傳分析。在基因分型實驗操作中，采用了工作效率和自動化程度均較高的Taqman基因分型實驗技術，并在實驗中采取了盲法等嚴格的質量控制措施，保證基因分型的準確性。

精神分裂癥的精神病理可能隨著文化和民族的不同而存在差異,這可能是種族和環境文化的差異所致。但目前我國有關少數民族人群精神分裂癥基因多態性的研究僅見對云南基諾族[7]、延邊朝鮮族的研究報道[8-9]，提示相關基因的變異可能與種族差異有一定關系。2007年廣西精神疾病流行病學調查結果顯示，廣西≥15歲的城鄉居民精神分裂癥終生患病率為9.77‰，其中壯族人群患病率為10.93‰[10]。壯族是我國人口第二多的民族，而有關壯族人群精神分裂癥易感基因的分子遺傳學研究鮮見報道。

本研究結果顯示，無論是在壯族、漢族樣本中，還是在總樣本人群中，病例組與對照組的PRODH-1945(T/C)基因型頻率、等位基因頻率分布無明顯差異。既往有關PRODH-1945(T/C)基因多態性與精神分裂癥的關聯研究結果并不一致:Li等[11]在中國人群中的研究報道PRODH-1945(T/C)/PRODH-1852(G/A)PRODH*1945T-C/PRODH*1852G-A單倍體與精神分裂癥的陽性關聯。然而，多數研究未能發現PRODH基因多態性與精神分裂癥之間有關聯[9，12-14]。目前有2個Meta分析也顯示PRODH-1945(T/C)與精神分裂癥之間的關聯無統計學意義[15-16]。本研究也并未發現PRODH-1945(T/C)(即rs372055)與精神分裂癥易感性有關聯,與既往多數研究結果相一致。

本研究雖然未發現PRODH-1945(T/C)基因多態性與壯族、漢族精神分裂癥易感性有關聯，但研究結果能為將來的Meta分析提供可利用的資料，為探明該遺傳變異在精神分裂癥發病機制中的真實作用提供參考數據。由于收集大數量的純民族精神分裂癥樣本相對困難，本研究的樣本量還不夠大，在今后的研究中，應擴大樣本量，進一步探討易患基因遺傳多態性在精神分裂癥易感性及其臨床表型發病機制中的作用機制。

1 Saha S,Chant D,Welham J,et al.A systematic review of mortality in schizophrenia:is the differential mortality gap worsening over time? [J].Arch Gen Psychiatry,2007,64(10):1123-1131.

2 Sullivan PF,Kendler KS,Neale MC.Schizophrenia as a complex trait:evidence from a meta-analysis of twin studies[J].Arch Gen Psychiatry,2003,60(12):1187-1192.

3 Mukai J,Liu H,Burt RA,et al.Evidence that the gene encoding ZDHHC8 contributes to the risk of schizophrenia[J].Nat Genet,2004,36(7):725-731.

4 Paterlini M,Zakharenko SS,Lai WS,et al.Transcriptional and behavioral interaction between 22q11.2 orthologs modulates schizophrenia-related phenotypes in mice[J].Nat Neurosci,2005,8(11):1586-1594.

5 Liu H,Heath SC,Sobin C,et al.Genetic variation at the 22q11 PRODH2/DGCR6 locus presents an unusual pattern and increases susceptibility to schizophrenia[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(6):3717-3722.

6 Ohtsuki T,Tanaka S,Ishiguro H,et al.Failure to find association betweenPRODHdeletion and schizophrenia[J].Schizophr Res,2004,67(1):111-113.

7 陳壯飛，曾勇，許秀峰，等.云南漢族、基諾族色氨酸羥化酶2基因rs1386494、G1463A多態性與精神分裂癥的關聯研究[J].中華臨床醫師雜志(電子版),2009,3(1):72-82.

8 李光哲，金美子，金九淼，等.延邊地區朝鮮族、漢族精神分裂癥患者5-羥色胺2A受體-1438A/G基因多態性的研究[J].中華精神科雜志,2006,39(2):93.

9 李光哲，許妍姬，金美子，等.延邊地區朝鮮族和漢族精神分裂癥患者脯氨酸脫氫酶-1945(T/C)基因多態性的對照研究[J].中國神經精神疾病雜志,2006,32(2):105-107.

10 韋波，陳強，馮啟明，等.廣西壯族自治區居民精神分裂癥流行病學調查[J].中國公共衛生,2011,27(10):1245-1247.

11 Li T,Ma X,Sham PC,et al.Evidence for association between novel polymorphisms in thePRODHgene and schizophrenia in a Chinese population[J].Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet,2004,129B(1):13-15.

12 Glaser B,Moskvina V,Kirov G,et al.Analysis ofPRODH,COMT and ZDHHC8 risk variants does not support individual or interactive effects on schizophrenia susceptibility[J].Schizophr Res,2006,87(1-3):21-27.

13 Williams HJ,Williams N,Spurlock G,et al.Association betweenPRODHand schizophrenia is not confirmed[J].Mol Psychiatry,2003,8(7):644-645.

14 姜萬奎,許青松.延邊地區朝鮮族、漢族人群脯氨酸脫氫酶和5-羥色胺2A受體基因基因座遺傳多態性[J].吉林醫學，2007,28(11):1320-1321.

15 Li D,He L.Association study of the G-protein signaling 4 (RGS4) and proline dehydrogenase (PRODH) genes with schizophrenia:a meta-analysis[J].Eur J Hum Genet,2006,14(10):1130-1135.

16 Allen NC,Bagade S,Mcqueen MB,et al.Systematic meta-analyses and field synopsis of genetic association studies in schizophrenia:the SzGene database[J].Nat Genet,2008,40(7):827-834.