腹腔鏡手術對子宮內膜癌細胞轉移潛能影響的實驗研究

黃守國，秦 杰，陳 瑾，程 虹，蒙 秋，張 靜，王海燕

子宮內膜癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%。手術治療的目的在于切除癌變組織及癌細胞可能轉移或已轉移的病灶，并同時進行全面的手術病理分期。傳統的子宮內膜癌手術方法對患者創傷較大，術后恢復慢。隨著腹腔鏡儀器的完善及器械的革新，腹腔鏡微創手術治療子宮內膜癌，效果更好[1-3]。本研究對子宮內膜癌腹腔鏡手術、開腹手術及腹腔鏡下全子宮切除術后子宮內膜標本手術前后的細胞凋亡率、腫瘤轉移促進基因MTA1和轉移抑制基因nm23-H1表達水平進行了對比研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2009年9月—2011年12月子宮病變(子宮內膜癌Ⅰ期及子宮良性病變)患者60例，根據患者病情及選擇的手術方法分為3組。子宮內膜癌Ⅰ期要求行腹腔鏡手術者20例進入腹腔鏡手術組：年齡47～73歲，平均(59.2±7.2)歲。子宮內膜癌Ⅰ期患者要求行開腹手術者20例進入開腹手術組：年齡48～70歲，平均(58.8±6.9)歲。子宮良性病變無生育需求，要求行腹腔鏡下全子宮切除術者20例進入空白對照組：年齡49～69歲，平均(57.7±6.3)歲?；颊咝g前均未進行化療、放療、生物治療等其他治療，排除其他系統合并癥及系統腫瘤等。

1.2 主要儀器與試劑 流式細胞儀：美國BD公司生產，熒光PCR儀：BIO-RAD公司，型號：MJ OPTICON2(美國)，Taq酶：貨號DR001A(TaKaRa，日本)，ReverTra Ace-a-反轉錄試劑盒：貨號FSK-100(TOYOBO，日本)，PCR擴增引物：MTA1、nm23-H1及β-actin的mRNA，設計引物探針所用軟件為Primer express 2.0軟件，由上海英駿生物技術有限公司合成，常規的化學試劑為國產分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本采集 3組患者標本均在術前0.5 h(排除患者本身日常生活及手術準備影響)內采取子宮內膜組織，術后即刻(保證離體子宮內膜組織的細胞凋亡率及基因表達未受其他因素影響)取子宮內膜組織，并置于-80 ℃冰箱待測。

1.3.2 流式細胞儀測定細胞凋亡率

1.3.2.1 單細胞懸液的制備 取受檢組織0.5～1.0 g，置于重疊的100目銅網及300目尼龍網上，切成1 mm×1 mm×1 mm碎塊，以眼科鑷持碎塊在網上揉搓，邊搓邊用磷酸緩沖液(PBS)將搓下的細胞沖洗液置于網下方的平面皿中，直至將組織搓完，收集細胞懸液于10 ml離心管中，以800 r/min離心5 min，以2 ml PBS液漂洗，再以1 500 r/min離心5 min，棄上清液，調整細胞數為106/ml，4 ℃保存。

1.3.2.2 細胞凋亡率的檢測 將細胞溶液吸人5 ml試管中，1 500 r/min離心5 min，以PBS液漂洗后再離心，PBS液漂洗后以100目篩網過濾，1 500 r/min再離心5 min，加入PI工作液0.5 ml(工作濃度為10 μg/ml)，室溫避光反應30 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率及細胞周期。檢測前以標準熒光微球調整儀器的變異系數并穩定在2%以內，上機收集2×104個細胞，熒光強度以對數放大，光散射數據存軟盤，測試完畢后用Modifit軟件(BD公司提供)分析數據。分析時用設門方法(橫坐標前向角，縱坐標側向角)將壞死細胞框除，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.3.3 實時熒光定量RT-PCR檢測MTA1、nm23-H1基因表達水平

1.3.3.1 引物探針 基因序列如下

1.3.3.2 引物探針/基因序列 (1)H β-actin forward/5′ GGA TGC AGA AGG AGA TCA CTG 3′；(2)H β-actin probe/FAM-CAG GAG GAG CAA TGA TCT TGA TCT TCATTGTGC-BHQ1；(3)H β-actin reverse/5′ CGA TCC ACA CGG AGT ACT TG 3′；(4)H MTA1 forward/5′CCT ACC TGC CCA TCA ACA GCG C3′；(5)h MTA1 probe/FAM-CCA TCA AGG CCG AGT GCA CGG CGC-BHQ1；(6)H MTA1 reverse/5′TCA GCA CCA GCG GGC TCT G3′；(7)H nm23-H1forward/5′TTT GAG CAG AAA GGA TTC C3′；(8)h nm23-H1 probe/FAM-TGT TGG TCT GAA ATT CAT GCA AGC TTC C-BHQ1；(9)h nm23-H1 reverse/5′AAC GTA GTG TTC CTT GAG3′。

1.3.3.3 人子宮內膜(癌)組織總RNA的提取 (1)從超低溫冰箱中取出人子宮內膜(癌)組織樣本，迅速用剪刀剪下約0.25 g樣品，置于預先加入200 μl RNAisoTMPlus的1.5 ml EP管中。(2)在RNAisoTMPlus溶液中破碎人子宮內膜(癌)組織，補充800 μl RNAisoTMPlus，混勻。在冰上靜置5 min，再加入200 μl氯仿，蓋緊后劇烈振蕩15 s(氯仿沸點低、易揮發，振蕩時應小心離心管蓋突然彈開)。待溶液充分乳化后，在冰上靜置5 min。(3)4 ℃，13 000 r/min高速離心樣品15 min后，將上層水相移至新管中，然后加入等體積的異丙醇，冰上放置10 min，4 ℃，13 000 r/min離心10 min。(4)棄上清，用1 ml 75%乙醇〔焦碳酸二乙酯(DEPC)水配制〕洗滌沉淀，來回顛倒數次，4 ℃，13 000 r/min離心5 min。(5)棄上清，空氣干燥RNA 10 min，用20 μl DEPC水溶解，立即取2 μl RNA做反轉錄，剩余18 μl-80 ℃凍存。

1.3.3.4 逆轉錄反應 抽提的總RNA進行反轉錄：取2 μl RNA模板做逆轉錄反應，反應體系如下：RNA的熱變性，先配好以下體系：25 μmol/L隨機引物(random primer)1 μl，DEPC水9 μl，RNA 2 μl，總共12 μl。65 ℃水浴5 min后迅速在冰上冷卻2 min，簡短離心收集反應液。反應液配置(20 μl體系)第一步變性后的RNA溶液12 μl，5×RT buffer 4 μl，dNTP mixture(各10 mmol)2 μl，RNase Inhibitor(10 U/μl)1 μl，Rever Tra Ace 1 μl；RT反應程序：30 ℃ 10 min，42 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。

1.3.3.5 熒光定量PCR反應 配制反應體系共25 μl：10 PCR buffer 2.5 μl，2.5 mmol dNTP 2 μl，dH2O 16 μl，15 μmol/L引物1+1 μl，15 μmol/L探針0.3 μl，5 U/μl Taq 0.2 μl，Template 2 μl，PCR buffer成分：100 mmol Tris-HCl緩沖液(pH=8.3)，500 mmol KCl，15 mmol MgCl2；反應過程：94 ℃ 2min，94 ℃ 5 s，55 ℃，30 s，40個循環，讀取羧基熒光素(FAM)熒光數值；30 ℃ 5 s。樣本同一個檢測指標基因統一上機，每個標本分別做2個待檢測基因以及內參β肌動蛋白(β-actin)的熒光定量PCR。

1.4 統計學方法 應用SPSS 19.0統計軟件進行分析，計量資料細胞凋亡率及基因表達量均采取配對樣本的t檢驗，以P<0.001為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 平均細胞凋亡率 腹腔鏡手術組術后子宮內膜癌平均細胞凋亡率較術前增高，差異有統計學意義(P<0.001)；開腹手術組和空白對照組手術前后子宮內膜癌平均細胞凋亡率無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.001，見表1)。

2.2 MTA1基因表達量 腹腔鏡手術組術后子宮內膜癌組織MTA1基因表達量較術前降低，差異有統計學意義(P<0.001)；開腹手術組和空白對照組手術前后MTA1基因表達量無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.001，見表1)。

2.3 nm23-H1基因表達量 腹腔鏡手術組術后子宮內膜癌組織nm23-H1基因表達量較術前增高，差異有統計學意義(P<0.001)；開腹手術組和空白對照組手術前后nm23-H1基因表達量無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.001，見表1)。

表1 3組標本手術前后細胞凋亡率、MTA1基因及nm23-H1基因表達量的比較

Table1 Comparison of specimens cell apoptosis rate，MTA1 gene and nm23-H1 gene expression amount before and after surgery in three groups

組別例數平均細胞凋亡率(%)MTA1基因表達量nm23-H1基因表達量腹腔鏡手術組20術前 3.55±0.60 0.062±0.0370.002±0.001術后25.23±2.160.012±0.0080.005±0.003t值-38.607.123-6.900P值0.0000.0000.000開腹手術組20術前3.58±0.540.061±0.0340.002±0.001術后3.60±0.520.076±0.0510.002±0.001t值-1.20-1.2330.606P值0.2460.2330.552空白對照組20術前28.23±1.090.002±0.0010.006±0.003術后28.18±1.320.003±0.0010.006±0.003t值0.28-1.227-0.316P值0.7840.2350.756

3 討論

腫瘤的發生源于細胞的異常增殖，表現為自主性生長的生物學行為。正常情況下，細胞的增殖與凋亡維持組織中細胞總數的動態平衡，一旦細胞的增殖異?；蚣毎蛲霭l生異常，均可導致細胞的惡性轉化，發生腫瘤。隨著研究工作的不斷深入，越來越多的資料表明，細胞凋亡異常在腫瘤的發生發展過程中占有重要位置。隨著細胞凋亡研究在醫學、生物學各個領域的不斷深入，發現細胞凋亡的誘導因素多種多樣。同一種組織和細胞受到不同因素的誘導，其凋亡的結果不盡相同，而一種誘導因素對不同的組織和細胞誘導凋亡的結果也不盡相同。細胞凋亡受體內、體外多種因素的影響，如系統信息、離子輻射及病毒感染等引起的細胞損傷、釋放細胞生長因子、細胞之間的相互作用以及激素釋放水平的變化，均影響細胞凋亡[4-5]。

本研究發現，在腹腔鏡手術機體環境改變時，子宮內膜癌細胞凋亡率由術前的(3.55±0.60)%升高至術后的(25.23±2.16)%，差異有顯著性；空白對照組正常子宮內膜細胞的凋亡情況手術前后無明顯變化；開腹手術對子宮內膜癌細胞的凋亡率亦未見明顯影響。這說明腹腔鏡手術時機體環境的改變作為一種誘因只影響子宮內膜癌細胞的凋亡狀態，且是一種升調節，而對正常子宮內膜細胞的凋亡情況沒有影響。同時本研究還表明子宮內膜癌細胞的凋亡情況不受開腹手術刺激的影響，可見腹腔鏡手術刺激作用有助于子宮內膜癌細胞的凋亡。

MTA1基因是從大鼠乳腺癌細胞系13762NF細胞中分離發現的，MTA1基因以共價修飾組蛋白、編碼轉錄因子、參與信號傳導途徑、調節有關基因的表達等方式，調節細胞的生長，影響腫瘤細胞的轉移。在MTA1過度表達的腫瘤一般均表現為深的漿膜層腫瘤浸潤度、高的淋巴結腫瘤轉移率和顯著的血管腫瘤侵襲性[6]。nm23基因是從K-1735鼠黑色素瘤細胞株中用消減雜交法分離出來的一種與惡性腫瘤轉移有關的基因，即腫瘤轉移抑制基因。人類nm23基因cNDA有兩個亞型即nm23-H1、nm23-H2。發生淋巴轉移的惡性腫瘤與未發生淋巴轉移者相比，nm23-H1的表達水平明顯降低，未發生淋巴轉移的惡性腫瘤患者的nm23-H1表達陽性率明顯高于發生淋巴轉移者[7]。

本研究發現，子宮內膜癌腹腔鏡術前轉移促進基因MTA1的表達水平明顯高于術后，轉移抑制基因nm23-H1的表達水平明顯低于腹腔鏡術后，兩者差異均有顯著性；子宮內膜癌開腹手術組及空白對照組正常子宮內膜組織中MTA1、nm23-H1基因表達量無明顯差異；子宮內膜癌腹腔鏡術后轉移促進基因MTA1表達量明顯低于子宮內膜癌開腹術后，而轉移抑制基因nm23-H1表達量明顯高于子宮內膜癌開腹術后。這說明在腹腔鏡手術時，機體腹腔內環境的改變對子宮內膜癌組織MTA1基因的表達呈降調節，nm23-H1基因的表達成升調節，通過影響細胞轉移參與調節子宮內膜癌細胞的轉移潛能，而開腹手術對MTA1、nm23-H1基因的表達無明顯影響，同時說明正常子宮內膜組織中以上兩基因的表達水平不受腹腔鏡手術環境改變的影響。

綜上，本實驗研究發現：腹腔鏡手術后子宮內膜癌細胞的凋亡率明顯上升，其機制可能與機體受腹腔鏡氣腹刺激，內環境動態失衡有關，并且可能通過升調節nm23基因的表達和降調節MTA1基因的表達，從而抑制其轉移潛能。而腹腔鏡手術對子宮內膜細胞凋亡率無影響，且不影響其nm23、MTA1基因的表達，這可能與機體細胞所處的功能狀態有關。從而可以得出腹腔鏡手術用于治療子宮內膜癌具有抑制其細胞的增殖和轉移能力的作用，是一種安全的手術方法。

1 Taylor SE，McBee WC Jr，Richard SD，et al.Radical hysterectomy for early stage cervical cancer：laparoscopy versus laparotomy[J].JSLS，2011，15(2)：213-217.

2 Maestri D，Reis RJ，Bacha OM，et al.A comparison of radical vaginal hysterectomy combined with extraperitoneal or laparoscopic pelvic lymphadenectomy in the treatment of cervical cancer[J].Int J Gynecol Cancer，2011,9.[Epub ahead of print].

3 Salicrú S，Gil-Moreno A，Montero A，et al.Laparoscopic radical hysterectomy with pelvic lymphadenectomy in early invasive cervical cancer[J].J Minim Invasive Gynecol，2011，18(5)：555-568.

6 Rao Y，Wang H，Fan L，et al.Silencing MTA1 by RNAi reverses adhesion，migration and invasiveness of cervical cancer cells(SiHa)via altered expression of p53，and E-cadherin/β-catenin complex[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2011,31(1)：1-9.

7 Wang QX，Wang TX，Liu WX.Expression of ERK and nm23-H1 in tongue squamous cell carcinoma and its relation with invasion and metastasis[J].Shanghai Kou Qiang Yi Xue，2011，20(3)：269-272.