125I－USPIO－bevacizumab用于肝細(xì)胞肝癌的SPECT／CT／MRI多模態(tài)顯像研究

趙焱昭 姚琦 吳冰 譚輝 鄔鵬躍 張春富 程登峰 石洪成

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 200032；2.上海市影像醫(yī)學(xué)研究所，上海 200032；3.上海交通大學(xué)Med－X研究院，上海 201101）

肝細(xì)胞肝癌（HCC）的早期診斷和治療非常重要，腫瘤直徑大于2 cm而不超過(guò)2 cm的HCC患者行肝癌切除術(shù)后5年生存率接近100%；腫瘤直徑不超過(guò)5 cm以及大于5 cm的HCC患者行腫瘤切除術(shù)后5年生存率分別為63.7%和34.9%［1－2］。影像學(xué)檢查是早期診斷HCC的重要方法。然而，單一的影像學(xué)技術(shù)對(duì)于診斷HCC有許多局限，如能聯(lián)合應(yīng)用其他多種成像技術(shù)，則可實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，為診斷HCC提供更加精確、全面的信息。本研究用直徑小于20 nm的超小超順磁性氧化鐵顆粒（ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）偶聯(lián)bevacizumab，合成 USPIO－bevacizumab，再經(jīng)125I標(biāo) 記，合 成125I－USPIO－bevacizumab，將 其 作 為SPECT／MRI雙模一體靶向腫瘤細(xì)胞的分子探針，對(duì)HepG2 HCC模型鼠進(jìn)行活體SPECT／CT及MRI顯像，以探討其用于HCC多模態(tài)顯像的潛力。

1 資料與方法

1.1 儀器 NanoSPECT／CT（美國(guó)Bioscan公司）；Magnetom Trio 3.0T超導(dǎo)型磁共振成像儀（德國(guó)Siemens公司）；CRC－15R活度計(jì)（美國(guó)Capintec公司）

1.2 試劑USPIO由上海交通大學(xué)Med－X研究院提供；bevacizumab購(gòu)自瑞士Roche公司；二乙基三胺五乙酸（DTPA）、1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N－羥基琥珀酰亞胺 （NHS）、吐溫、二乙基三胺五乙酸二酐（DTPA二酐）、四氯二 苯 基 甘 脲 （Iodogen ）、COOH－PEG－COOH、COOH－PEG－NH2購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；高锝酸鈉（Na99mTcO4）淋洗液、碘125－碘化鈉（Na125I）溶液購(gòu)自上海欣科醫(yī)藥有限公司；Whatman 3MM層析色譜紙購(gòu)自美國(guó)GE公司；二氯甲烷、氯化亞錫、丙酮購(gòu)自上海紅星試劑廠。

1.3 細(xì)胞 人HCC細(xì)胞株HepG2由復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所提供。用DMEM培養(yǎng)基（內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清、青霉素100 U／mL和鏈霉素100 μg／mL）在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)HepG2，每隔48 h換液1次；用0.05%胰酶（含0.02%EDTA）消化，并傳代。

1.4 裸鼠HCC皮下移植瘤模型的建立 SPF級(jí)Balb／c雄性裸鼠（4～6周齡，15～20 g）購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，用0.1 mol／L的PBS調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×108個(gè)／mL；在Balb／c雄性裸鼠左肩處皮下注射0.1 mL細(xì)胞懸液；當(dāng)腫瘤體積達(dá)100～300 mm3時(shí)（注射后1～2周），對(duì)荷瘤裸鼠行相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均遵守復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)范。

1.5 USPIO－bevacizumab的合成 USPIO－bevacizumab的合成路線如圖1所示。實(shí)驗(yàn)流程：以0.01 mol／L PBS（pH＝7.4）為溶劑配制 COOH－PEGCOOH 及COOH－PEG－NH2溶液，濃度均為1 mg／mL。將 2 mL COOH－PEG－NH2、2mL COOHPEG－COOH、4 mL Fe3O4透析液以及22 mL0.01 mol／L PBS（pH＝7.4）混合，配制30 mL USPIO混合液，室溫下超聲1 h。

圖1 USPIO－bevacizumab的合成路線

將上述30 mL USPIO（20μg／mL）混合液置于最大分離范圍為10 kD的超濾管中，以5000 r／min離心10 min，離心后上層剩余溶液約5 mL；再加入PBS5 mL，5000 r／min離心10 min，重復(fù)2次，除去游離的PEG；然后將離心后殘留液體轉(zhuǎn)移至最大分離范圍3 kD的超濾管中，6000 r／min離心15 min，此時(shí)管中殘留液體約2 mL；將剩余溶液靜置后可觀察到沉淀，上清液呈深棕色，為COOH－PEG－NH2／Fe3O4／COOH－PEG－COOH 納米磁流體。

向8 mL PBS中加入2μL吐溫并混合；將10 mg EDC和10 mg NHS溶于200μL該混合液；將200μL含有EDC和NHS的溶液加入到前述離心后得 到 的 2 mLCOOH－PEG－NH2／Fe3O4／COOH－PEG－COOH納米磁流體中；溶液振蕩30 min后轉(zhuǎn)移至最大分離范圍3 kD的超濾管中，6000 r／min離心5 min；加入25 mg／mL的bevacizumab50μL，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中以250 r／min的速度振蕩2 h；得到 USPIO－bevacizumab 1.5 mL，其中含鐵0.15 mg，bevacizumab 1.25 mg。

1.6125I標(biāo)記bevacizumab及 USPIO－bevacizumab在涂有Iodogen（約10μg）的反應(yīng)管中依次加入2 μL bevacizumab（25mg／mL）、50μL Na125I的 PBS溶液（370 MBq／mL，PBS：0.05 mol／L），輕輕混勻后，室溫反應(yīng)10 min。用甲醇和水的混合溶液作為展開劑，用Whatman3mm層析試紙為固定相測(cè)定標(biāo)記率，125I－bevacizumab的Rf＝0，Na125I的Rf＝0.8。

1.7 HepG2荷瘤裸鼠顯像

1.7.1 注射125I－bevacizumab后 HepG2荷瘤裸鼠的NanoSPECT／CT顯像 荷瘤裸鼠的 Nano－SPECT／CT顯像在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科進(jìn)行。取1只HepG2荷瘤裸鼠，經(jīng)尾靜脈注射100μL含37 MBq125I－bevacizumab的PBS溶液；分別在注射后2 h以及24 h腹腔注射100μL2.5%巴比妥鈉麻醉裸鼠，行NanoSPECT／CT全身顯像，監(jiān)測(cè)小鼠體內(nèi)腫瘤對(duì)125I－bevacizumab的吸收情況。小鼠在進(jìn)行SPECT顯像之前首先進(jìn)行CT掃描，CT掃描參數(shù)：幀分辨率256×512，球管電壓45 kVp，電流0.15 mA，曝光時(shí)間500 ms／幀，小鼠全身掃描時(shí)間約為7 min；在采集圖像的同時(shí)采用Nucline 1.02軟件（匈牙利Mediso公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)圖像3D重建。CT掃描結(jié)束后，進(jìn)行同機(jī)SPECT掃描，SPECT掃描選用4個(gè)高分辨9孔板，配合錐形準(zhǔn)直器同時(shí)實(shí)現(xiàn)圖像的高分辨及高靈敏度，能峰28 keV，窗寬10%，掃描參數(shù)選擇1 mm／pixel的分辨率、256×256的矩陣排列以及24個(gè)投影和60 s掃描時(shí)間，小鼠全身掃描約需24 min；掃描完成后，采用Hi－SPECT軟件 （美國(guó)Bioscan公司）進(jìn)行3DOSEM重建圖像，重建算法采用4個(gè)子集及6次迭代計(jì)算，重建分辨率為0.4 mm／pixel。

1.7.2 注射125I－USPIO－bevacizumab后 HepG2荷瘤裸鼠的NanoSPECT／CT顯像 取1只HepG2荷瘤裸鼠，經(jīng)尾靜脈注射含100μL37 MBq125I－USPIO－bevacizumab的PBS溶液，分別在注射后2 h以及24 h腹腔注射100μL2.5%巴比妥鈉麻醉裸鼠，行NanoSPECT／CT全身顯像，監(jiān)測(cè)小鼠體內(nèi)腫瘤對(duì)125I－USPIO－bevacizumab的吸收情況。采集和重建處理參數(shù)見(jiàn)1.7.1。

1.7.3 注射 USPIO－bevacizumab后 HepG2荷瘤裸鼠的3T Trio磁共振成像 磁共振成像在華東師范大學(xué)認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)研究所進(jìn)行：取1只HepG2荷瘤裸鼠，經(jīng)腹腔注射100μL2.5%巴比妥鈉麻醉，采用3T Trio磁共振成像系統(tǒng)行全身顯像；然后經(jīng)尾靜脈注射含100μL USPIO－bevacizumab的PBS溶液，24 h后腹腔注射100μL2.5%巴比妥鈉麻醉裸鼠，采用3T Trio磁共振成像行全身顯像，監(jiān)測(cè)小鼠體內(nèi)腫瘤對(duì)USPIO－bevacizumab的吸收情況。2次3T Trio磁共振成像的掃描參數(shù)一致，均為：TR＝1500 ms，TE＝75 ms，F(xiàn)OV＝75 mm×100 mm，矩陣 ＝192×256，層厚 ＝2 mm。掃描完成后，所有磁共振圖像經(jīng)目測(cè)均匹配相應(yīng)層面的模型鼠腫瘤信號(hào)改變。

1.8 免疫組化染色 尾靜脈注射125I－USPIO－bevacizumab的荷瘤裸鼠行NanoSPECT／CT顯像后斷頸處死，取腫瘤組織，經(jīng)質(zhì)量濃度為4%的甲醛固定，石蠟包埋，以4μm的厚度連續(xù)切片，分別作VEGF和CD34免疫組化染色。

2 結(jié) 果

2.1 以125I－bevacizumab為分子探針的HepG2荷瘤裸鼠的NanoSPECT／CT顯像 通過(guò)紙層析法測(cè)得125I－bevacizumab的標(biāo)記率為92.5%。HepG2荷瘤裸鼠注射125I－bevacizumab 后，2 h 及 24 h 的SPECT／CT顯像（圖2），在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均可見(jiàn)明顯的腫瘤放射性濃集；從2 h到24 h，背景放射性逐漸降低，感興趣區(qū)（ROI）定量分析顯示，腫瘤的放射性吸收（ID%）從2.3% （2 h）上升至2.5% （24 h）。

圖2 HepG2荷瘤裸鼠注射125I－bevacizumab后2h（A）和24h（B）NanoSPECT／CT顯像

2.2 以125I－USPIO－bevacizumab 為分子探針的HepG2荷瘤裸鼠的 NanoSPECT／CT顯像HepG2荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射125I－USPIO－bevacizumab后，2 h及24 h行NanoSPECT／CT顯像（圖3），在這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)腫瘤組織均有放射性攝取；ROI定量分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織的放射性吸收（ID%）為0.54%（2 h）和1.04%（24 h），背景的放射性攝取隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低。

圖3 HepG2荷瘤裸鼠注射125I－USPIO－bevacizumab后2h（A）和24h（B）NanoSPECT／CT顯像

2.3 HepG2荷瘤裸鼠注射 USPIO－bevacizumab后的3T Trio MRI顯像 HepG2荷瘤裸鼠尾靜脈注射USPIO－bevacizumab前后均行3T Trio MRI T2 WI加權(quán)顯像（圖4）。注射顯像劑后，模型鼠肝臟與腫瘤組織同一層面的信號(hào)均較注射顯像劑前低，顯示為明顯的T2效應(yīng)（信號(hào)丟失）。可通過(guò)腫瘤部位和肝臟區(qū)域的不同減低程度來(lái)勾畫出感興趣區(qū)。

圖4 HepG2荷瘤裸鼠注射USPIO－bevacizumab前（A）和注射后24h（B）的3TTrio MRI顯像

3.4 HepG2荷瘤裸鼠注射125I－USPIO－bevacizumab后的免疫組化染色 CD34在HepG2肝癌組織間的血竇內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)呈強(qiáng)表達(dá)，顯示為強(qiáng)棕黃色，表明有新生血管的存在；肝癌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)彌漫表達(dá)VEGF，表達(dá)強(qiáng)度為中等。

圖5 HepG2荷瘤裸鼠注射125I－USPIO－bevacizumab后免疫組化染色：CD34（A），VEGF（B）

3 討 論

HCC的功能性核醫(yī)學(xué)顯像手段主要包括PET和SPECT。PET具有高靈敏度以及高分辨率的特點(diǎn)，對(duì)早期診斷HCC有較高價(jià)值；然而，目前最常用的PET顯像劑氟代脫氧葡萄糖（18F－FDG）用于HCC的診斷時(shí)，陽(yáng)性檢出率僅為50%［3］。其他的PET分子探針，如11C標(biāo)記的乙酸鹽（11C－acetate）、膽堿（11C－choline）與FDG比較，陽(yáng)性檢測(cè)率有所提高，但是，它們均不適用于體積較小、分化程度較高的惡性HCC以及腫瘤轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)［4］。MRI對(duì)于HCC的診斷及預(yù)后評(píng)估有較高的價(jià)值，可提供精確的解剖影像，且具有低電離輻射、高軟組織對(duì)比度和靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。然而，盡管MRI診斷HCC的敏感度達(dá)80%，但仍有30%～50%的肝內(nèi)病灶（直徑大多＜2 cm）被漏診［5］。目前，釓、鐵等的造影劑已經(jīng)被應(yīng)用于MRI分子影像領(lǐng)域。USPIO作為MRI陰性造影劑，能在T2 WI上表現(xiàn)為低信號(hào)，具有良好的T2 WI加權(quán)成像的對(duì)比增強(qiáng)效果，因此已用作MRI的分子探針［6］。

多模態(tài)成像技術(shù)能夠同時(shí)提供高特異性的功能成像信息和高靈敏度、高對(duì)比度的解剖成像信息，優(yōu)于任何一種單一形式的影像技術(shù)。目前，PET／SPECT／MRI多模態(tài)成像技術(shù)，尤其是在多模態(tài)納米探針的研究方面，已取得很大進(jìn)展［7］。USPIO共價(jià)耦聯(lián)間皮素表達(dá)的結(jié)合抗體mAbMB并進(jìn)行111In標(biāo)記的產(chǎn)物111In－mAbMB－USPIO已被應(yīng)用于胰腺癌腫瘤的SPECT／MRI研究［8］。經(jīng)DTPA修飾的USPIO偶聯(lián)乳糖酸并進(jìn)行99mTc標(biāo)記的產(chǎn)物99mTc－DTPA－SPION－LBA也已被應(yīng)用于HepG2肝細(xì)胞癌的SPECT／MRI雙模態(tài)顯像前期研究［9］。

VEGF與HCC的發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［10］，故選擇VEGF作為HCC顯像的靶點(diǎn)有利于提高顯像的特異性并有助于肝癌的分期診斷及療效評(píng)價(jià)。bevacizumab是美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的第一個(gè)抗血管生成類抗體藥物，能特異性地結(jié)合VEGF－A。目前，標(biāo)記111In和89Zr的bevacizumab已被成功用于宮頸癌的SPECT以及PET顯像［11］。

通過(guò)以上分析發(fā)現(xiàn)，以bevacizumab作為靶向分子，偶聯(lián)USPIO并進(jìn)行同位素標(biāo)記，可以作為SPECT／PET／MRI顯像劑并能很好地用于 HCC顯像。采用與124I核素原子結(jié)構(gòu)及標(biāo)記方法類似的125I核素標(biāo)記納米顆粒進(jìn)行SPECT以及MRI顯像，具有一定的研究?jī)r(jià)值。

本研究中，HepG2荷瘤裸鼠注射125I－bevacizumab后，腫瘤部位呈現(xiàn)出明顯的放射性濃集，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，放射性濃集進(jìn)一步加強(qiáng)，顯示了125I－bevacizumab的腫瘤靶向性及特異性。HepG2荷瘤裸鼠注射125I－USPIO－bevacizumab后，腫瘤的攝取較注射125I－bevacizumab后弱，而在肝臟的放射性濃集較125I－bevacizumab注射后進(jìn)一步增強(qiáng)。肝臟保持較高的放射性濃集與正常肝臟中大量枯否細(xì)胞（Kupffer cell）對(duì)納米顆粒的吞噬作用有關(guān)。但是，我們也發(fā)現(xiàn)，直接應(yīng)用125I標(biāo)記的bevacizumab顯像時(shí)，放射性信號(hào)主要集中在腫瘤組織的邊緣；然而，125I標(biāo)記的bevacizumab與USPIO偶聯(lián)后，放射性信號(hào)可在腫瘤的中央部位發(fā)現(xiàn)，在實(shí)體瘤內(nèi)部分布更加均一；這符合納米顆粒在實(shí)體瘤內(nèi)的高通透性和滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)）。盡管本研究中肝臟放射性背景較高，但因腫瘤對(duì)125I－USPIO－bevacizumab的吸收主要是與腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF有關(guān)，故通過(guò)該特異性濃集能反應(yīng)腫瘤的生長(zhǎng)情況。僅通過(guò)SPECT顯像難以精確勾畫出腫瘤組織，本研究以USPIO作為bevacizumab的載體，因USPIO為磁性四氧化三鐵，當(dāng)納米顆粒直徑小于30nm時(shí)則具有超順磁性，故可用于MRI顯像（本實(shí)驗(yàn)采用的USPIO經(jīng)光鏡分析微粒直徑小于20nm）；因此，借助 MRI T2 WI加權(quán)顯像對(duì)ROI進(jìn)行勾畫，再借助融合軟件對(duì)SPECT的吸收進(jìn)行定量分析，可對(duì)HCC的病理學(xué)進(jìn)程進(jìn)行活體在線定量分析。

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