二氧化鋯包覆的二氧化硅核殼型填料的制備及在選擇性吸附磷脂中的應(yīng)用研究

摘要：提出了一種基于ZrO2iO2核殼型材料吸附磷脂的分析方法。首先利用N2O內(nèi)部水解法制備了含不同比例ZrO2包覆的ZrO2iO2核殼型顆粒并通過電鏡和紫外吸收漫反射圖譜對其進(jìn)行了表征，證明在iO2表面包覆有ZrO2材料。采用RPPLELReversedphasehighperformanceliquidchromatographyevaporativelightscatteringdetector以甲醇水（含醋酸銨）為流動相，優(yōu)化并建立了種磷脂的分析方法。在以上基礎(chǔ)上將ZrO2iO2核殼型材料制成固相萃取olidphaseextractionPE小柱，以種磷脂標(biāo)準(zhǔn)品為研究對象，用RPLEL方法評價了PE小柱吸附磷脂的效率。發(fā)現(xiàn)包覆有%和7%rO2的ZrO2iO2核殼型材料吸附磷脂的能力均強(qiáng)于單純的ZrO2材料，且%的ZrO2iO2核殼型材料吸附效果最好，并將其初步應(yīng)用于血清中磷脂的選擇性吸附，結(jié)果表明，通過PE富集后，能檢測到更多的磷脂類代謝產(chǎn)物。

關(guān)鍵詞：磷脂；二氧化鋯；核殼；固相萃取；高效液相色譜

1引言

磷脂（PhospholipidsPLs）是含有磷酸的脂類，它為兩性分子，一端為親水的含磷酸基團(tuán)的極性頭基，另一端為疏水的含有兩條長脂肪酸鏈的非極性尾部。磷脂是生物體內(nèi)細(xì)胞膜的重要組成部分，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要作用，它也與許多疾病的發(fā)生有關(guān)，可作為某些疾病的信號分子。磷脂分為兩大類：甘油磷酯類和鞘脂類，甘油磷脂又分為卵磷脂、腦磷脂、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇等，所以磷脂的種類繁多。

基于磷脂結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，磷脂分析是一個挑戰(zhàn)。常用的有薄層色譜法（L）、核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（M）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GM）和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LM）等技術(shù)。L法靈敏度和分辨率都較低，且易引起磷脂的氧化和分解；GM不適合于直接分析磷脂，因?yàn)榱字瑳]有揮發(fā)性，需要經(jīng)水解、甲酯化等處理；1PNMR可利用磷原子1P來分析各種磷脂，但NMR法的靈敏度較低，僅限于磷脂酰膽堿等組織中含量較高的磷脂樣品的測定；M法，特別是電噴霧質(zhì)譜EIM是目前磷脂分析中應(yīng)用最多的軟電離法，EIM法前處理簡單，分析時間短，不足之處在于難以分析豐度較低的磷脂。在此基礎(chǔ)上，an等又開發(fā)了基于源內(nèi)分離的“鳥槍法和多維質(zhì)譜法測定磷脂和其他脂質(zhì)分子。PLEIM具有高分辨率、高靈敏度和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是磷脂分析的較好工具，但儀器價格昂貴。蒸發(fā)光散射檢測器（Evaporativelightscatteringdetector，EL）作為一種新型通用型檢測器它價格便宜，且無L和GM分析磷脂的缺點(diǎn)，在分析過程中不易引起磷脂的氧化和分解，適合直接分析磷脂，在磷脂分析中具有很好的可行性。

在生物樣品中磷脂種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，低豐度檢測困難，且干擾較多。如果在應(yīng)用上述方法分析前，先對磷脂進(jìn)行選擇性提取，對于體內(nèi)的磷脂分析，特別是對發(fā)現(xiàn)一些微量的信號分子是很重要的。常用的磷脂提取方法有甲基叔丁基醚（Methyltertbutylether，ME）液液萃取法和固相萃取法（PE）。PE比較常用的是氨丙基、氨基或二醇基修飾的硅膠等正相材料，但這些方法選擇性普遍不高。

金屬氧化物（如ZrO2等）由于具有路易斯酸堿的特性，在酸性條件下可以與帶有磷酸基團(tuán)的物質(zhì)結(jié)合，達(dá)到與其它物質(zhì)分離的目的，在堿性條件下洗脫則可達(dá)到富集的目的，故金屬氧化物選擇性富集磷脂是非常有前景的方法，但ZrO2本身存在比表面積小，顆粒粒徑小，不適合做PE填料等缺點(diǎn)。本研究采用N2O內(nèi)部水解法，將ZrO2負(fù)載在球形硅膠微球之上，制成核殼型ZrO2iO2顆粒，并填充為PE小柱，用于選擇性富集磷脂，并采用RPLEL進(jìn)行評價。結(jié)果表明，本研究獲得的核殼型ZrO2iO2顆粒具有良好的富集效率，在生物樣品分析中有很好的應(yīng)用前景。

2實(shí)驗(yàn)部分

21儀器與試劑

himadzuL2A高效液相色譜儀（日本島津公司）；ELUM蒸發(fā)光散射檢測器上海通微分析技術(shù)有限公司；X8A漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；飛鴿牌GL16G高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；22電子天平北京賽多利斯儀器有限公司；Molatom18a摩爾原子型超純水器（重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司）；8場發(fā)射掃描電子顯微鏡日本itachi公司Lambda9紫外可見近紅外分光光度計美國；8反相高效液相色譜柱2mm

ymbolt@ 6mm，μm，蘇州環(huán)球色譜有限公司；

溶血磷脂酰膽堿（1Palmitoyl2hydroxysnglycerophosphocholinelysoP16∶），溶血磷脂酰膽堿（1tearoyl2hydroxysnglycerophosphocholinelysoP18∶），磷脂酰膽堿12imyristoylsnglycerophosphocholineMP磷脂酰乙醇胺1Palmitory2oleoylsnglycerophosphoethanolaminePOPE磷脂酰膽堿（1Palmitory2oleoylsnglycerophosphocholinePOP）均購于美國AvantiPolarLipids公司；乙酸銨（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；2μm球形硅膠蘇州環(huán)球色譜公司；ZrOl2·82Ο（上海阿拉丁試劑有限公司；乙腈、甲醇（色譜純，上海星可生化有限公司）；異丙醇、正己烷色譜純，上海阿拉丁試劑有限公司；氯仿分析純，國藥試劑有限公司；氨水（分析純，平湖化學(xué)試劑廠）。

22實(shí)驗(yàn)方法

221ZrO2iO2填料制備采用N2O內(nèi)部水解法＼[121＼]制備二氧化鋯包覆的二氧化硅核殼結(jié)構(gòu)填料。過程為：采用相當(dāng)于%ZrO2iO2，ww的ZrOl2·82O水溶液多次浸潤2μm球形硅膠，并在6℃不斷攪拌直至干燥；在1℃下干燥6h，將ZrOl2負(fù)載的iO2放置進(jìn)1%氨水環(huán)境中，在6℃下水浴約～6h，然后在℃馬弗爐內(nèi)煅燒數(shù)小時，即得到%（ZrO2iO2，ww）包覆的ZrO2iO2核殼型材料。7%ZrO2iO2（ww）核殼型材料制備方法與上相似。本實(shí)驗(yàn)中所用ZrO2對照材料由ZrOl2·82O直接煅燒得到。

222固相萃取步驟將mgrO2iO2顆粒裝填在1mLPE小柱內(nèi)，PE小柱的頂部和底部分別放入聚丙烯篩板。取1μL磷脂標(biāo)準(zhǔn)品或者血漿磷脂提取物，溶解在μL含1%甲酸的正己烷異丙醇（2∶8VV）溶液內(nèi)，加入到ZrO2iO2填充的PE小柱中，平衡后回收流出液，記為流出液（Nobindingsolution）；用μL正己烷異丙醇（2∶8VV）溶液清洗PE小柱，回收清洗液，記為清洗液（ashingsolution）；分別用μL7molL氨水甲醇溶液洗脫，共次合并洗脫液，記為洗脫液（Elution）。

而對于ZrO2，上樣、清洗和洗脫步驟同上述PE方法相同。只是采用離心的方法，渦旋min靜置min1rmin離心min，取上清液。得到流出液、清洗液和洗脫液后，揮干，分別用1μL甲醇復(fù)溶，備用。