基于聚吡咯修飾膨脹石墨電極的甲胎蛋白電化學免疫傳感器

摘要：構建了測定人血清中甲胎蛋白AP的電化學免疫傳感器。此免疫傳感器的制備采用恒電位法在膨脹石墨EG電極表面合成聚吡咯PPy，再以戊二醛GA作為交聯劑，固定辣根過氧化酶標記的AP抗體RPantiAP。此免疫傳感器在含AP的溶液中于℃溫育min后，再在傳感器表面修飾普魯士藍P作為電子介體，抗原抗體免疫結合產生的免疫復合物會導致RP對P催化氧化的效率降低。在優化條件下，AP的濃度在1～μgL范圍內呈線性關系，檢出限為62pgmLN=。這種基于PPy修飾EG電極的免疫傳感器制備簡單，靈敏度高且價格低廉，有望成為一次性電化學免疫傳感器。

關鍵詞：甲胎蛋白；膨脹石墨；電化學免疫傳感器；酶標抗體；普魯士藍

1引言

甲胎蛋白AP是一種胚胎發育早期的主要血清蛋白，成人由肝細胞產生，含量極微，血清中AP的升高對原發性肝癌診斷具有重要意義＼[1＼]。目前，放射免疫法RIA是公認的準確測定AP的方法，但存在放射性污染。近年來，各種采用非放射性標記的免疫技術相繼建立，并得到迅速發展。免疫傳感器是耦聯含有抗原抗體分子的生物敏感膜與信號轉換器的一種新型生物傳感器，其測定原理基于抗原或半抗原和其特異性抗體結合形成穩定的抗原抗體復合物＼[2＼]。電化學免疫傳感器由于具有很高的特異性和靈敏度而成為近年來的研究熱點之一＼[＼]。然而，該類傳感器常需要采用鉑、金等貴金屬或者玻碳作為電極材料，這些電極價格昂貴，限制了可拋棄型電化學免疫傳感器的發展。因此，基于一次性傳感表面的可拋棄型電化學免疫傳感器的研究顯得尤為重要。有關絲網印刷電極在電化學免疫傳感器中的應用已有報道＼[＼]，這類電極的主要優點在于可批量生產、一次性使用、檢測操作簡單等。膨脹石墨EG作為一類新型炭材料具有良好的導電性和化學穩定性＼[6＼]且制備容易符合基底電極的要求[7]。

聚吡咯PPy是一類功能高分子，可用于制作直接電化學電極功能基質膜。聚合物包埋法是一種傳統的抗體固定化方法＼[8＼]，然而包埋法可能會使抗體變性，失去活性。而且大部分的抗體包埋于聚合物基底中，不能與抗原有效結合＼[9＼]。本研究將PPy膜修飾到EG電極上，利用其活性基團亞氨基與交聯劑戊二醛GA的一個醛基發生交聯；GA上的另一個醛基用于結合辣根過氧化酶標記的AP抗體RPantiAP。然后在傳感器表面修飾一層普魯士藍P，由于P具有較好的電化學活性，因而可用于電子介體。酶標抗體上的RP能催化P的電化學氧化，因此根據峰電流的大小變化，可確定待測樣品中AP的含量，從而制備了AP免疫傳感器。2實驗部分

21儀器與試劑

JM66LA型掃描電子顯微鏡日本電子株式會社，I66型電化學工作站華科普天科技有限公司。AP酶聯免疫試劑盒上海領潮生物科技有限公司。兩份人血清樣品由常州市第二人民醫院提供。

22基于聚吡咯修飾膨脹石墨電極的AP免疫傳感器的構建

根據文獻＼[1＼]，將天然鱗片石墨氧化后制備EG。稱取7gEG，用壓片機壓制成片狀的EG電極。將面積為1×cm2的EG電極浸入到含1molL吡咯，2molLNal中作為工作電極，分別以鉑片和飽和甘汞電極E作為對電極和參比電極，在工作電極上施加8V的電位使吡咯單體在EG電極表面發生聚合。聚合1s后，將EG電極取出，用去離子水洗凈，在室溫下干燥，即得到PPy膜修飾的EG電極。將該修飾電極浸入到2%GA溶液中活化h，得到膨脹石墨聚吡咯戊二醛EGPPyGA電極。將1μLRPantiAP滴加到電極表面，在℃下溫育min，再用p7的P沖去松散結合的酶標抗體，晾干；在固定了酶標抗體的傳感器表面滴加μL2μgLAP抗原標準溶液，用于考察該免疫傳感器的最佳工作條件。

2普魯士藍的固定及免疫傳感分析

三電極系統：以修飾了RPantiAP和AP抗原的EG電極為工作電極，鉑電極為對電極，E為參比電極。電解質溶液含2molLl、2molLKl、mmolLKeN6和mmolLel溶液，恒電位V聚合s合成P，再將電極置于1molLl1molLKl溶液中，以mVs的掃速在

ymbolm@@ ～V之間循環伏安掃描至穩定即得到修飾了P的免疫傳感器。