替考拉寧手性柱高效液相色譜法拆分萘哌地爾對映體及分離機制

摘要：在極性有機相條件下用替考拉寧手性柱（hirobitotic）直接分離萘哌地爾對映體?？疾炝巳野?、醋酸的濃度、比例及柱溫、流速對拆分的影響。應用MolecularoperationEnvironment（MOE）軟件模擬R萘哌地爾與替考拉寧的相互作用，結合熱力學參數探討其分離機制。結果表明，隨著甲醇中三乙胺和醋酸的濃度變小，分離度增大；三乙胺與醋酸的體積比為1∶1時分離度最好。溫度和流速的升高都會使分離度降低。優化后條件為：流動相為甲醇三乙胺醋酸（1∶2∶2，VV），流速1mLmin柱溫℃。在此條件下，萘哌地爾對映體達到了最佳分離，分離度為2，理論塔板數達到1。結合熱力學參數和分子模擬結果表明，引起手性識別的主要作用力包括氫鍵、立體阻礙和ππ作用力。

關鍵詞：高效液相色譜法；分離機制；分子模擬；替考拉寧色譜柱；萘哌地爾

1引言

萘哌地爾Naftopidil屬于苯哌嗪類衍生物，其結構中含有一個手性碳原子，因而具有一對對映異構體，目前以消旋體形式應用于臨床。萘哌地爾主要用于治療高血壓病和良性前列腺增生＼[12＼]。Pastoris等＼[＼]對萘哌地爾消旋體及單一對映體進行了藥理活性研究發現，右旋萘哌地爾對大鼠膀胱體積容量V基礎值的改變大于左旋萘哌地爾，關于其單一對映體的藥理、毒理作用及藥代動力學有待進一步研究。

手性拆分對于制藥工業和藥理學研究非常重要[4]。盡管對映體的物理化學性質幾乎完全相同，但是它們的生化、藥理及毒理作用卻可能存在很大差別＼[5＼]。因此，建立萘哌地爾的拆分方法對其深入研究對映體的藥效研究很有必要。手性藥物的拆分方法主要包括PLGE等。PL是手性拆分的主要工具，而開發功能強大的手性選擇劑是PL法得以應用的主要原因＼[6～8＼]。替考拉寧作為一種新型手性選擇劑，既可以用于反相、正相模式，也可以用于極性有機相模式＼[9＼]。替考拉寧手性柱（hirobiotic）已用于分離大量消旋化合物，如羥丙基腎上腺素＼[10＼]、氯前列醇＼[11＼]、氨基醇類＼[12＼]、氨基酸及其衍生物＼[13～15＼]等。其拆分機理綜合了蛋白質、環糊精等手性固定相所具有的特點，同時又具有較高的柱容量，成為目前極具有發展潛力的手性固定相。肖溶等＼[16＼]已使用hiralpakAR手性柱在反相模式下拆分了萘哌地爾。本研究采用高效液相法，通過替考拉寧手性柱在極性有機相模式對萘哌地爾對映體進行拆分，還系統考察了流動相中三乙胺、醋酸的比例和用量、柱溫及流速對手性拆分的影響。應用MOEMolecularoperationenvironment軟件模擬R萘哌地爾與替考拉寧的相互作用，結合熱力學參數探討其手性拆分機制。

2實驗部分

21儀器與試劑

高效液相色譜系統由島津L2A輸液泵、PM2AA檢測器、IL2A自動進樣器、O2A色譜柱恒溫箱、L_solution色譜工作站組成。p2型酸度計上海偉業儀器廠。甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司），三乙胺、醋酸（分析純，南京化學試劑有限公司），萘哌地爾（99%，先聲藥業）。所用軟件：Molecularoperatingenvironment（MOE）281。

22色譜條件

hirobiotic色譜柱（1mm×6mmμm美國Astec公司），流動相為甲醇三乙胺醋酸（1∶2∶2，VV），柱溫℃，流速1mLmin檢測波長282nm，進樣體積μL。所有流動相使用前經過μm的微孔濾膜過濾，并超聲脫氣min。色譜死時間通過進樣KI溶液測定。

2分子模擬

通過MOE軟件中的uilder模塊構建（R萘哌地爾結構，并應用MMff9立場對構建的結構進行能量最低化。從P（Proteindatabank）數據庫中下載替考拉寧的三維結構，并補齊缺失的原子和鍵。應用相同的立場對其結構進行優化。用能量優化后的R萘哌地爾與替考拉寧進行對接。在ocking的程序中，選擇替考拉寧為受體、R萘哌地爾為配體，alphatriangle為放置方法，LondondG為打分函數。

將對接后打分函數最低的R萘哌地爾構象用于動力學模擬。首先將替考拉寧和R萘哌地爾復合物結構進行能量最低化。當能量穩定后，即RM（Rootmeansquared）梯度達到1時，就可以通過ynamics程序進行動力學模擬過程。程序中選擇NV（Numberofparticles，volumeandtemperature）作為EnsembleNPA（NoséPoincaréAnderson作為Algorithm。動力學時間設為1ps，每ps采集一次數據。

萘哌地爾與替考拉寧的對接及動力學過程除將萘哌地爾選為配體外，其余過程同上。

結果與討論

1反相條件下的拆分

反相條件下甲醇三乙胺醋酸為緩沖液拆分萘哌地爾對映體。然而，萘哌地爾對映體在反相條件下的保留時間較長，并且不能被分離。從圖1可見，保留因子呈曲線分布，在7%甲醇時保留最小。這是由于在反相條件下，大多數化合物在hirobiotic柱上的保留呈U型分布＼[14＼]。在緩沖液的比例較高時，對映體與固定相之間存在很強的疏水作用力。在甲醇含量較高時，對映體與固定相之間主要是親水作用力。在此實驗條件下，甲醇含量約為7%時，作用力發生轉變。對比圖1中的條曲線，保留因子（k）的順序：p>p1>p6。而oesten等＼[17＼]的研究表明p值對保留的影響與pKa值沒有必然聯系，可能由于p值的變化同時改變了萘哌地爾對映體和固定相的電離狀態，在p時，萘哌地爾與固定相之間的作用力最強，導致保留延長。