IIO玻璃芯片上溫度分布對成肌細胞生長增殖的影響

摘 要：為了研究不同溫度對小鼠成肌細胞生長增殖的影響在IO玻璃芯片上加載電場形成一定的溫度分布在不同溫度（38、39、0和1℃）所對應的區域加工相同尺寸的PM微型培養腔室用于小鼠成肌細胞的培養通過對芯片上培養的小鼠成肌細胞連續d的熱刺激（30min/d）研究不同溫度短期熱刺激對成肌細胞增殖的影響細胞形態顯微觀察和流式細胞儀檢測結果表明一定的溫度刺激對小鼠成肌細胞的增殖有促進作用其中0℃刺激后的細胞數目增加最明顯在總刺激時間（30min）相同情況下短時多次熱刺激的效果更理想細胞增殖指數最高可達3839

關鍵詞：IO玻璃；成肌細胞；熱刺激；細胞周期；細胞增殖

013011收稿；01301接受

本文系國家自然科學基金（Nos81071783107088）教育部“新世紀優秀人才支持計劃”（NoNCE0908）和中央高校基本科研業務費“研究生科技創新基金”項目（NoCX113006）資助

1 引 言

溫度與細胞生長關系密切一直是細胞體外培養研究中的熱點細胞體外培養的適宜溫度一般為37～38℃溫度過高或過低都會影響細胞的生長將乳腺癌腫瘤細胞系MAM31在37～℃進行培養觀察表明溫度的變化會影響細胞形態改變細胞骨架從而改變細胞生長狀況或者引起細胞死亡＼1＼另一些實驗則證實較低的溫度可以促進某些細胞對特定蛋白質的表達＼＼

細胞溫度特性的研究促進了其在臨床應用中的快速發展＼3＼目前熱物理治療已成為發展最快的臨床醫學物理學方法之一它常作為一種簡單、有效的治療方式廣泛用于肌肉損傷修復中＼＼熱物理治療所引起的肌肉細胞的變化機制目前仍不是十分明確熱刺激對成肌細胞（keletalmyoblast）生長狀態的影響可能是其中的一個重要途徑＼＼成肌細胞是指胞漿中含有肌絲的肌組織前體細胞來源于中胚層干細胞胚胎發育都經歷了由間充質細胞分化為成肌細胞然后分裂、融合成為多核肌纖維形成肌小管再進一步分化為成熟肌細胞的過程在成熟個體中不含成肌細胞而是以處于靜止狀態的肌衛星細胞的形式存在該衛星細胞位于肌纖維基底膜與肌膜之間當肌肉發生損傷時衛星細胞就會被激活大量增殖、融合并分化產生新生肌纖維＼6＼在臨床和基礎研究中通過成肌細胞自我更新和促進肌纖維再生可治療各種肌肉拉傷、損傷、凍傷和肌肉丟失性疾病所以成肌細胞的增殖速度、融合率的高低直接影響疾病治療的效果在熱物理治療中合適的熱刺激強度對成肌細胞的生長增殖至關重要體外培養成肌細胞并觀察不同溫度對其增殖的影響對指導肌肉損傷的熱物理治療有積極意義

目前關于細胞溫度特性的研究常采用細胞培養器皿整體加熱的方式實現細胞易污染每次只能進行單一溫度的測試分析＼7＼而且實驗步驟繁瑣、細胞和試劑消耗大實驗觀察不方便微加工和微流控技術的發展特別是微全分析系統概念的提出＼8＼開創了細胞芯片這一新的研究領域而基于IO玻璃的微芯片在溫度控制、實驗操作和觀察方面具有突出優點＼9＼因此本研究利用IO玻璃作為加熱源和細胞培養芯片的基底考察溫度短期熱刺激對成肌細胞生長增殖的影響本方法可以實現準確的溫度控制成肌細胞的熱刺激響應測試結果與傳統水浴方法一致而且在同一芯片上可以同時研究多個溫度、溫度刺激模式甚至一定溫度梯度對細胞的影響與傳統方法相比本方法操作簡單、效率更高、試劑消耗少、便于觀察分析

實驗部分

1 儀器與試劑

CO細胞培養箱（美國orma公司）超凈工作臺（中國冠鵬凈化公司）倒置顯微鏡、數碼照相機（日本Olympus公司）臺式離心機（日本ubota公司）流式細胞儀（美國ectonickinson公司）恒流源（上海實博教儀公司）等離子清洗儀（中國恒業電子公司）紅外測溫儀（中國華盛昌公司）IO單面導電玻璃（龍乾玻璃廠）

成肌細胞培養基包含78%am10動物細胞培養基（美國yclone公司）0%胎牛血清（etalcalfserum美國yclone公司）；胰蛋白酶（北京翰譜公司）；1%NaCO3、1%青鏈霉素、Ⅰ型膠原蛋白（上海碧云天公司）；聚二甲基硅氧烷（PolydimethylsiloxanePM美國owCorning公司）；P緩沖液（匯林試劑公司）

芯片加工 由于PM具有很強的通氣性和可塑性可用來制作微型培養腔室＼1011＼：首先將PM單體與固化劑按10∶1均勻混合脫氣除去氣泡后均勻澆注在水平放置的模板框槽中80℃固化1h后再從模板上取下

圖1 細胞培養微芯片

ig1 Microchipforcellculture

IO：Indiumtinoxide；PM：polydimethylsiloxane

形成一個與IO玻璃等邊長的厚度為0cm的膠塊即邊長為cm×cm×0cm；根據仿真及測量結果在玻璃表面不同溫度分布區域選定相應培養腔室（直徑為8mm）位置用打孔器將PM膠塊相對應的區域挖空；利用等離子清洗儀將PM和IO玻璃的不導電面進行鍵合；用導電膠將銅電極固定在IO玻璃導電面即得到實驗所用的細胞培養芯片（圖1）

3 實驗過程

31 細胞培養芯片的包被

小鼠成肌細胞是貼壁生長細胞在培養前需要對培養芯片進行膠原蛋白包被使細胞更容易貼壁生長培養芯片經高溫高壓滅菌處理后在超凈臺上進行包被操作向各培養腔室中加入適量的膠原蛋白溶液0min后吸出溶液；放置1h后加入P緩沖液清洗對培養腔室中的膠原蛋白進行堿性去除；～6min后吸出P同樣步驟重復兩次最后放置8h封裝后放入冰箱℃儲藏備用

3 細胞培養與實驗分組 為保證實驗結果可靠選取第三代細胞胰酶消化后調整細胞密度為1×10/mL均勻接種于各培養腔室中在37℃%CO條件下預培養h 分析化學第1卷

第8期張曉娟等：IO玻璃芯片上溫度分布對成肌細胞生長增殖的影響

33 溫度刺激 玻璃培養芯片加載7V的穩定電壓即可得到所需的刺激溫度分布每天刺激30min更換新鮮培養液以避免溫度升高引起的水分與營養的丟失然后放入培養箱繼續培養連續刺激d整個過程在完全無菌條件下進行實驗采用兩種溫度刺激模式一是連續刺激30min二是短時多次刺激總刺激時間30min

3 細胞收集及流式細胞儀分析

連續刺激d后收集細胞固存用于流式細胞儀分析采用兩步消化法消化貼壁的成肌細胞：（1）加入P緩沖液清洗中和殘余的培養液有利于增強下一步胰酶蛋白酶的消化作用；（）在37℃細胞培養箱內消化1min鏡下細胞基本上都從壁上脫落加入培養液終止消化細胞懸液放入離心管離心去掉廢液后加入P緩沖液將離心的細胞吹散清洗再次離心去掉P緩沖液清洗兩次的細胞加入到1～mL70%～7%的酒精中固存h后即可進行流式細胞檢測

3 結果與討論

31 仿真分析

采用IO玻璃作為加熱源一方面是因為IO玻璃的表面溫度隨施加的電壓不同而改變便于精確控制；另一方面在IO玻璃上加載一定電壓后由于電流量的區別可以形成不同溫度區域以及特定的溫度梯度分布同時細胞可以直接培養在IO玻璃上不僅避免了溫度由加熱源到培養器皿之間傳遞的時間延擱和由此產生的誤差而且在單一玻璃培養芯片上就能實現多種熱刺激模式大大簡化了實驗操作提高實驗效率避免污染

IO薄膜在可見光范圍透射率極高可達9%以上不會影響顯微鏡對細胞的觀察＼1＼本研究選用邊長為cm、厚度為11mm、電阻為100Ω的單面導電IO玻璃在電極上加載一定電壓后IO玻璃的薄膜電阻導電發熱使玻璃表面溫度升高由于加載電極的位置與長度不同溫度分布有很大的差異為了選擇適宜細胞溫度特性研究的溫度分布需要對加電后玻璃表面的溫度分布情況進行仿真分析仿真采用ComsolMultiphysics3a軟件（美國Comsol公司）所運用的偏微分方程1～電加熱方程：