雙重信號放大的乙酰膽堿酯酶電化學(xué)傳感器檢測有機(jī)磷農(nóng)藥

1引言

有機(jī)磷農(nóng)藥（Organophosphate pesticide， OP）是目前使用量最大的農(nóng)藥種類之一，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中植物病蟲害的防治。不合理地使用OP，使其在植物體內(nèi)大量殘留。該類農(nóng)藥屬于強(qiáng)的神經(jīng)毒劑，能不可逆地抑制人體內(nèi)乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase， AChE）的活性^[1]，使其催化水解乙酰膽堿的能力受到抑制，導(dǎo)致乙酰膽堿在體內(nèi)積累，從而使人體神經(jīng)系統(tǒng)中一些生理功能受到影響，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡^[2，3]。因此，建立一種響應(yīng)快速、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠的檢測OP的新方法具有重要意義。

目前，氣相色譜法^[4-6]、高效液相色譜法^[7-9]、氣相色譜質(zhì)譜法^[10]等已廣泛用于檢測OP，而且能夠得到準(zhǔn)確的結(jié)果，但這些方法大多儀器貴重、操作復(fù)雜、耗費(fèi)時(shí)間長，不便于現(xiàn)場檢測。近年來，電化學(xué)傳感檢測方法因其操作簡單、響應(yīng)快速、靈敏度高、儀器便宜等優(yōu)點(diǎn)更是備受關(guān)注。目前OP的電化學(xué)傳感檢測方法^[11-14]一般利用其對AChE的不可逆抑制作用，通過檢測AChE催化水解氯化乙酰硫代膽堿（Acetylthiocholine， ATCl）產(chǎn)生硫代膽堿氧化電流的大小，實(shí)現(xiàn)痕量有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測。有機(jī)磷農(nóng)藥對AChE的抑制率與硫代膽堿的氧化電流的減小量成正比，但是其氧化電位較高，其它干擾物質(zhì)在這一電位下也會氧化，產(chǎn)生氧化電流，造成干擾。

本研究構(gòu)建一種新型AChE電化學(xué)傳感器，用于OP的檢測。首先，金電極表面的AChE在沒有納米金種子的情況下催化底物ATCl產(chǎn)生硫代膽堿，硫代膽堿還原氯金酸，生成納米金種子；將電極置于銀增強(qiáng)液中，納米金催化銀在較低的電位下沉積形成銀包金的核殼結(jié)構(gòu)，而聚集的銀又進(jìn)一步催化更多Ag+還原，用溶出伏安法定量檢測沉積銀的量，實(shí)現(xiàn)了信號的再次放大。該傳感器基于生物催化納米金粒子的生成和納米金粒子電催化銀沉積，實(shí)現(xiàn)了信號的雙重放大，而在沒有納米金顆粒的區(qū)域，銀不會被催化還原^[15-17]，使得背景電流很小，與其它電化學(xué)AChE傳感器相比，具有更低的背景干擾和檢出限^[18，19]。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

CHI 900B電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；三電極系統(tǒng)：殼聚糖修飾的組裝了乙酰膽堿酯酶的金電極（AChECHIT/Au）為工作電極，飽和Hg2Cl2電極（SCE）為參比電極，鉑電極為輔助電極。用CHI 660C工作站，于5 mmol/L Fe（CN）64

氯化乙酰硫代膽堿、乙酰膽堿酯酶（Type C3389，500 U/mg）和戊二醛（25%），購自美國SigmaAldrich公司；馬拉硫磷（標(biāo)準(zhǔn)品）、殼聚糖Chitosan（CHIT，脫乙酰度為85%）、氯金酸 （HAuCl4·4H2O）、AgNO3、磷酸鹽緩沖液（PBS， pH=7.4）、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀等。其它試劑均為分析純，水溶液均用超純水配制。1.0 mol/L NH32.0×10

Symbolm@@ 3 mol/L AgNO3的混合溶液作為銀增強(qiáng)劑溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

2.2AChEChitosan 修飾電極的制備

用2.0 mol/L 乙酸溶液溶解殼聚糖，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%（w/V） 的殼聚糖溶液，用NaOH溶液調(diào)至pH=5.0，放于冰箱中備用。

金電極在修飾前，先分別用0.3和0.05 μm的氧化鋁粉拋光至形成鏡面，再將電極于超純水、乙醇和超純水中各超聲5 min洗凈，用N2吹干。在打磨處理好的金電極表面滴加3 μL 0.5%（w/V） 殼聚糖溶液，在室溫下過夜晾干，然后用超純水清洗，N2吹干。將5 μL 20 U/mL的乙酰膽堿酯酶溶液和1 μL戊二醛（2.5%）混合液滴于電極表面，置于濕氣盒中反應(yīng)1 h，構(gòu)建成乙酰膽堿酯酶和殼聚糖修飾的金電極（AChECHIT/Au）。

2.3對乙酰膽堿酯酶抑制劑的檢測

實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示，將AChECHIT/Au電極浸在含有不同濃度馬拉硫磷的磷酸鹽溶液（PBS）中，室溫下反應(yīng)15 min，然后用PBS溶液沖洗干凈，N2吹干。再在AChECHIT/Au修飾電極上滴加20 μL 納米金生成液（0.05%（V/V）HAuCl43 mmol/L ATCl），室溫下反應(yīng)15 min，用超純水清洗，N2吹干。再將電極置于1.0 mol/L NH3（1）AChECHIT/Au電極；（2）滴加納米金生成液的AChECHIT/Au電極；（3）電沉積銀的AuNPs/AChECHIT/Au電極。

（1） AChECHIT/Au； （2） AChECHIT/Au with the treatment of AuNPs growth solution； （3） AuNPs/AChECHIT/Au with the electrochemical deposition of silver.[HT5][TS）]

3.2不同修飾電極銀的溶出檢測

將AChECHIT/Au修飾電極在酶催化生成納米金和進(jìn)一步電沉積銀后在0.1 mol/L HNO3溶液掃LSV，通過比較銀的溶出電流來分析有機(jī)磷對乙酰膽堿酯酶的抑制性（圖3）。在AChECHIT/Au電極上滴加20 μL 0.05% HAuCl4，在

Symbolm@@ 0.10 V電位下電沉積銀后于0.1 mol/L HNO3溶液中線性掃描，未得到銀的溶出響應(yīng)峰（曲線1）。向組裝好的酶電極滴加20 μL納米金生成液（含3 mmol/L ATCl ），電沉積銀后在0.27 V出現(xiàn)顯著的溶出響應(yīng)峰，

10 V電位下，銀在生成的納米金粒子表面沉積，因此滴加了含3 mmol/L ATCl的納米金生成液的AChECHIT/Au電極得到明顯的銀溶出響應(yīng)峰，而滴加了0.05% HAuCl4的酶電極沒有明顯的銀溶出峰。馬拉硫磷作為一種有機(jī)磷農(nóng)藥，能不可逆地抑制乙酰膽堿酯酶的催化活性，使電極表面酶催化底物水解生成的硫代膽堿的量減少，進(jìn)而還原生成的納米金粒子也減少，在納米金粒子表面沉積的銀也就隨之減少，在0.27 V得到的銀的溶出響應(yīng)峰明顯減小，約45 μA（曲線3）。由此可見，通過檢測銀的溶出響應(yīng)峰可實(shí)現(xiàn)馬拉硫磷有機(jī)磷農(nóng)藥的高靈敏檢測。

3.4ATCl的濃度和納米金生成時(shí)間的影響

納米金粒徑的數(shù)目和大小直接影響銀沉積的量，納米金粒子越多，銀沉積就越多，同時(shí)納米金粒徑又會影響納米金粒子的催化活性，通常小粒徑納米金比大粒徑納米金具有更好的催化活性，因此選擇合適的納米金沉積條件，可顯著提高傳感器響應(yīng)性能。

考察了ATCl的濃度對銀溶出電流的影響（圖6a），隨著ATCl濃度的增大，銀溶出電流先增大后減小，當(dāng)?shù)孜餄舛葹? mmol/L時(shí)溶出電流最大。這可能是由于ATCl的濃度增大使生成硫代膽堿的量增多，還原生成的納米金粒子增多，在納米金表面上催化電沉積銀的量增多。當(dāng)ATCl的濃度超過3 mmol/L，還原生成的納米金粒子可能主要在原來的納米金粒子表面長大，使粒徑增加，但總的納米金粒子數(shù)量沒有增加，導(dǎo)致催化電沉積在納米金粒子上銀的量反而減小。因此，ATCl的最佳濃度選擇為3 mmol/L。

催化反應(yīng)時(shí)間是影響納米金生成的另一個重要因素，隨著納米金生液反應(yīng)時(shí)間延長，銀溶出電流先增大后減小，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為15 min時(shí)，銀溶出電流達(dá)到最大（圖6b），其原理類似ATCl濃度變化對納米金生成的影響。因此選擇15 min為最佳納米金生成時(shí)間。

方法對馬拉硫磷的檢測有良好的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性。

采用本電極對湘江水進(jìn)行檢測，未檢測出有機(jī)磷農(nóng)藥。故采用加標(biāo)回收法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該傳感器的準(zhǔn)確性，每一樣品平行測定5次，測得結(jié)果如表1所示，回收率在95.5%-102.2%。

4結(jié)論

基于生物催化生成納米金和納米金催化銀沉積兩個階段，實(shí)現(xiàn)了對有機(jī)磷農(nóng)藥的高靈敏檢測。在沒有納米金種子的情況下催化生成納米金顆粒，為了再次實(shí)現(xiàn)信號放大，降低背景電流，于

Symbolm@@ 0.10 V的電壓下在生成的納米金顆粒表面電沉積銀，最后采用高靈敏的溶出伏安法對電沉積的銀定量檢測。本方法具有高靈敏度和低檢測背景的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)低濃度有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測。

References

1MENG FanPing， HE DongHai， ZHU XiaoShan， YANG ZhengXian， MA DongDong. Chinese J. Anal. Chem.， 2005， 33（7）： 922-926

孟范平， 何東海， 朱小山， 楊正先， 馬東東. 分析化學(xué)， 2005， 33（7）： 922-926

2Mileson B E， Chambers J E， Chen W L， Dettbarn W， Ehrich M， Eldefrawi A T， Gaylor D W， Hamernik K， Hodgson E， Karczmar A G， Padilla S， Pope C N， Richardson R J， Saunders D R， Sheets L P， Sultatos L G， Wallace K B. Toxicol. Sci.， 1998， 41（1）： 8-20

3ZHAO JianZhuang， ZHAO Fan， ZHEN WeiHua， CHAI LiNa， LIANG GuiZhi. J. Beijing Agric. Coll.， 2003， 18（2）： 137-141

趙建莊， 趙 帆， 鄭偉華， 柴麗娜， 梁桂芝. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2003， 18（2）： 137-141

4Rotiroti L， Stefano L D， Rendina I， Moretti L， Rossi A M， Piccolo A. Biosens. Bioelectron， 2005， 20（10）： 2136-2139

5Xiao Q， Hu B， Yu C H， Xia L B， Jiang Z C. Talanta， 2006， 69（4）： 848-855

6Su Y S， Jen J F. J. Chromatogr. A， 2010， 1217（31）： 5043-5049

7Chen P S， Huang S D. Talanta， 2006， 69（3）： 669-675

8Leandro C C， Hancock P， Fussell R J， Keely B J. J. Chromatogr. A， 2006， 1103（1）： 94-101

9PérezRuiz T， MartinezLozano C， Tomas V， Martin J. Anal. Chim. Acta， 2005， 540（2）： 383-391

10WANG Yao， LIU ShaoBin，XIE CuiMei， ZHANG HanXia，LU WeiHua. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（1）： 67-71

王 耀，劉少彬，謝翠美，張漢霞，盧偉華. 分析化學(xué)，2011， 2011， 39（1）： 67-71

11Vakurov A， Simpson C E， Daly C L， Gibson T D. Biosens. Bioelectron.， 2004， 20（6）： 1118-1125

12Kok F N， Hasirci V. Biosens. Bioelectron.， 2004， 19（7）： 661-665

13SUN ChunYan， LI HongKun， PING Hong， WANG ErLei， ZHANG MinWei. Chem. J. Chinese Universities， 2011， 32（11）： 2533-2538

孫春燕， 李宏坤， 平 紅， 王二雷， 張民偉. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 32（11）： 2533-2538

14Schulze H， Vorlová S， Villatte F， Bachmann T T， Schmid R D. Biosens. Bioelectron.， 2003， 18（23）： 201-209

15EscosuraMuniz A D L， Costa M M， Merkoci A. Biosens. Bioelectron.， 2009， 24（8）： 2475-2482

16Lee T M H， Cai H， Hsing I. Electroanalysis， 2004， 16（19）： 1628-1631

17Lee T M H， Cai H， Hsing I. Analyst， 2005， 130（3）： 364-369

18Du D， Chen S Z， Cai J， Zhang A D. Biosens. Bioelectron.， 2007， 23（1）： 130-134

19Luo X L， Xu J J， Du Y， Chen H Y. Anal. Biochem.， 2004， 334（2）： 284-289