整體柱在線固相萃取液相色譜聯用系統測定

水中苯胺類污染物

液相色譜聯機分析中的萃取柱及閥體系與液相色譜兼容的問題進行研究， 構建了與液相色譜進樣量相兼容的大內徑整體萃取柱及相關閥、泵送系統。采用四甲氧基硅烷（TMOS）和甲基三甲氧基硅烷（MTMS）作為混合前驅體， 制備了大內徑（530 μm）、柱床均一、穩定的毛細管硅膠整體柱。經C18基團修飾后， 前沿分析表明該整體柱具有大的吸附容量， 其中N甲基苯胺約為214 mg/g， N，N二甲基苯胺約為388 mg/g。柱通透性好， 在線固相萃取時僅需注射泵即可完成。將該整體柱應用于本實驗室自主研發的樣品前處理儀上并與液相色譜聯機后， 采用85%甲醇水作為流動相， 在0.5 mL/min的流速和254 nm紫外檢測波長下對水中痕量苯胺類化合物進行在線富集與分離分析。在0.1， 1和10 mg/mL添加水平下， 湘江水中苯胺類化合物的回收率為81.9%-91.3%；日內與日間相對標準偏差均低于7.6%。

1引言

在線固相萃取液相色譜法是一種新的全自動分析技術， 集樣品凈化、富集及分離分析于一體， 已在環境、生物等樣品分析中得到廣泛應用^[1-3]。該系統的關鍵部分為萃取柱和切換系統， 常常存在成本高（需使用另外的高壓液相色譜泵完成固相萃取）、與液相色譜兼容性差（柱容量、進樣量等）等問題^[4]。因此， 研究兼容性好、成本低廉的在線固相萃取系統對于此新技術的發展有重要意義。

整體柱是一種用有機或無機聚合方法在色譜柱內進行原位聚合的連續床固定相^[5，6]， 與常規裝填的色譜柱相比， 具有更好的多孔性和滲透性^[7]。此特性使得整體柱的阻力小， 用于在線固相萃取柱時可有效降低對輸液泵的壓力要求， 在在線預濃縮及固相萃取方面已有所應用^[8]。

本研究采用四甲氧基硅烷和甲基三甲氧基硅烷混合單體， 利用溶膠凝膠法^[9]在530 μm內徑的毛細管中制備了柱床結構均勻良好、溶劑耐用性好、與液相色譜分離容量相匹配的整體C18硅膠基整體柱， 通過自制的全自動樣品前處理儀與液相色譜儀聯機， 建立了操作簡便、設備成本低的在線固相萃取液相色譜分析系統， 并在該系統上通過在線富集方式檢測了環境水樣中痕量苯胺類污染物。在分析環境水樣中的痕量污染物時， 常規高效液相色譜最低檢出限相對較高， 對進樣量有一定要求， 小內徑的整體柱在作為萃取柱使用時， 常因為其柱容量較小， 萃取量有限而只能與微型液相色譜儀器在線聯用^[10]。大內徑硅膠整體柱相比小內徑整體柱具有較大的柱容量， 其作為萃取柱使用時在進樣量和流動相流速方面能夠與高效液相色譜相匹配， 提高了儀器兼容性。與將萃取柱和分離柱連接到在同一個六通閥的雙閥裝置^[11]相比， 本裝置采用的雙閥結構將萃取柱和分離柱分別連接在兩個六通閥上， 在閥切換過程中不需要改變流動相流速， 流動相通過液相色譜泵可直接將洗脫液送入檢測器中進行分析檢測， 大大降低了色譜圖基線的波動， 提高了實驗重現性。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

UB100i光學顯微鏡（重慶澳浦光電技術有限公司）；JSM6490LV型掃描電鏡（日本JEOL公司）；DZKW型電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫療儀器廠）；KQ3200E型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；DF101S型集熱式磁力攪拌器（金壇市醫療儀器廠）；LSP021B型注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；HP5890Ⅱ型氣相色譜儀（HP， Palo Alto， CA，USA）；7K82B型真空干燥箱（上海市實驗儀器廠）；彩陸牌紫外檢測器（北京彩陸科學儀器有限公司）；超高壓液相色譜（UPLC， Waters公司）， AS63六路三切換全自動樣品前處理儀（本實驗室生產）。石英毛細管（530 μm i.d.， 690 μm o.d.， 河北永年銳澤色譜器件有限公司）。

HPLC分析條件：色譜柱為SpherigelC18柱（200 mm×4.6 mm， 5 μm， 大連江申公司）；流動相為85%甲醇水；流速為0.5 mL/min；紫外檢測器波長選用254 nm。

甲基三甲氧基硅烷（MTMS， SigmaAldrich公司）；四甲氧基硅烷（TMOS， 北京百靈威科技有限公司）；十八烷基三甲氧基硅烷（日本東京化成工業株式會社）；尿素（Urea， 長沙市有機試劑廠）；聚乙二醇（PEG， Mr=10000， 成都金山化學試劑有限公司）；冰醋酸、甲苯、硫脲、N甲基苯胺、N，N二甲基苯胺（分析純）；甲醇（色譜純）；實驗用水由MilliQ超純水系統提供。

2.2整體柱的制備

稱取適量聚乙二醇和尿素， 用0.01 mol/L醋酸溶液充分溶解后，緩慢滴加適量四甲氧基硅烷和甲基三甲氧基硅烷。混合物在冰浴下劇烈攪拌40 min， 并超聲10 min， 充入內壁經預處理的毛細管內， 在35 ℃恒溫水浴鍋中反應24 h， 120 ℃干燥3 h， 依次用水、甲醇沖洗。將柱子放入真空干燥箱50 ℃下干燥12 h， 再從50 ℃升溫到330 ℃（1 ℃/min）， 330 ℃保持20 h。利用十八烷基三甲氧基硅烷對制備的整體柱進行表面修飾， 制得C18整體柱。將做好的C18整體柱按要求截成適宜長度， 作為富集柱。

2.3在線固相萃取液相色譜聯用裝置分析過程

采用實驗室自制的全自動樣品前處理儀將整體萃取柱與高效液相色譜系統連接， 用于在線固相萃取的系統流路見圖1， 實驗所制整體柱作為富集柱放置于閥1定量環處。閥2首先處于裝樣（LOAD）狀態， 流動相85%（V/V）甲醇水， 以0.5 mL/min的流速通過色譜泵直接進入分離色譜柱， 使基線保持穩定。

在富集過程開始前， 閥1處于Load狀態， 先分別用甲醇和去離子水沖洗和活化富集柱， 將萃取裝置內氣泡趕走；然后用注射器A以10 μL/min將300 μL待富集液注入定量環處的萃取小柱進行富 集，持續30 min， 富集后的殘留液通過廢液口排出裝置外。將閥1切換至進樣（Inject）狀態， 用注射器B以10 μL/min將洗脫液甲醇注入萃取小柱， 洗脫下來的溶液通過管路進入閥2定量環（100 μL）處。將閥2切換至進樣狀態， 85%（V/V）甲醇水通過定量環將洗脫液帶入分離柱進行分析，

在254 nm波長下得到由紫外檢測器記錄的色譜圖。用去離子水沖洗整個萃取裝置， 準備下一次富集分析過程。

3結果與討論

3.1大內徑整體柱的制備條件優化及其富集性能考察

3.1.1制備條件優化為了使得萃取整體柱的吸附容量與液相色譜的檢測容量相匹配， 并能耐受高含量有機溶劑， 宜采用大內徑、無機整體柱。目前制備內徑較大的毛細管整體柱， 多以3.1.2對苯胺類物質的富集性能將注射泵和紫外檢測器聯用， 在線檢測整體柱對苯胺類物質的萃取效果。采用去離子水沖洗整個管路， 用注射泵以5 μL/min的流速將10 mg/L硫脲溶液、N甲基苯胺溶液和N，N二甲基苯胺溶液分別注入5 cm經C18修飾的整體柱， 尾端與紫外檢測器連接， 在254 nm

下檢測各物質的突破曲線。從圖3可見， 以突破曲線上升部分中段為標準， 硫脲、 N甲基苯胺和N，N二甲基苯胺的突破時間分別約為8.1， 29.5和46.9 min。由此可得出整體柱對N甲基苯胺的富集量約為1070 ng， 對N，N二甲基苯胺的富集量約為1940 ng， 具有較好的富集效果。

3.2整體柱在線固相萃取洗脫條件考察

富集過程完成后， 在接下來的洗脫過程中， 洗脫液的量對富集效果有很大影響。洗脫液量太少， 則富集柱內有殘余；洗脫液量太多， 則洗脫下來的物質會通過定量環從廢液口排出。考察了洗脫液體積對富集效果的影響（圖4）， 當洗脫液體積小于40 μL時， 富集柱內有較多殘余未洗下來；當洗脫液體積大于80 μL時， 洗脫體積太大， 洗脫下的物質部分從廢液口流走， 嚴重影響富集效率。綜合考慮， 選用60 μL甲醇作為洗脫液。富集流速也對富集效果有影響， 當流速增大時， 待富集物與固定相作用時間短， 會造成部分流失。對比了不同流速

3.3江水中痕量苯胺污染物在線固相萃取液相色譜分析

在優化條件下取過膜后的湘江水300 μL（添加N甲基苯胺和N，N二甲基苯胺標準品的質量濃度為0.1 mg/L）， 分別采用富集后進樣與直接進樣（添加N甲基苯胺和N，N二甲基苯胺標準品的質量濃度為10 mg/L， 進樣1 μL）進行分析（圖5）。經富集后， 兩種樣品的峰高明顯高于直接進樣時的峰高， 說明該整體柱微萃取和高效液相色譜在線聯用富集分析方法可降低分析檢出限， 提高分析靈敏度。

4結論

利用溶膠凝膠法制備了大內徑的毛細管硅膠整體柱。整體柱經C18基團修飾后， 具有較大的富集量。將C18修飾的整體柱與在線固相萃取液相色譜分離系統連接， 建立了在線富集和檢測水環境中苯胺類污染物含量的分析方法。 本方法簡單、靈敏度高， 適用于水中痕量苯胺類污染物的在線分析檢測。

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