利用凝集素修飾的二氧化硅玻璃球去除膠原蛋白中的內毒素

摘要[HTSS]利用凝集素分子對醣類有專一性吸附特性，對內毒素結構中的多醣類成分進行吸附，建立了凝集素去除膠原蛋白溶液中內毒素的吸附系統。二氧化硅玻璃經酸蝕，再以胺基硅烷進行胺化后，將凝集素嫁接其上。結果表明，1， 2和5 g/L的凝集素對于膠原蛋白溶液中內毒素吸附率皆大于99%；30顆嫁接凝集素玻璃球可去除8.4 mL膠原蛋白溶液（濃度為2 g/L）中內毒素（去除率大于99%）。未來更可將嫁接凝集素玻璃球填充于管柱內部，利用管柱分離法去除膠原蛋白溶液中內毒素，建立有效、操作簡單且成本低廉去膠原蛋白溶液內毒素裝置。

1引言

隨著組織工程技術的迅速發展，許多組織修復生物性取代材料紛紛問世，并已成功應用于皮膚、外圍神經、牙周組織及齒槽骨等組織再生領域。其中，膠原蛋白是眾多取代材料中應用最為廣泛，且最具潛力的生物材料。膠原蛋白應用范圍涵蓋保健營養品、化妝品和高階醫藥等眾多產業，利用其生物兼容性、具生物可降解性、抗菌性與止血性等優點，經適當后續處理后，可控制其在體內分解速率并可加工成不同的應用型態^[1]。 此外，膠原蛋白還可依據臨床應用的需求，制成薄膜、海綿狀、粉末或纖維織品等多種形態， 作為止血、整型外科及燒燙傷敷料等臨床應用。然而，市面上販賣的膠原蛋白多受到內毒素存在的困擾，許多以膠原蛋白為原料的醫用產品，常會因為其內毒素含量過高，造成材料與生物體接觸或植入后產生嚴重免疫反應而限制其應用。因此，尋求有效去除內毒素方法，對于發展膠原蛋白材料在醫用產品方面的應用極其重要。

內毒素為革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的一部份，革蘭氏陰性菌的細胞膜內層為磷酯層，內毒素則是存在于外膜。內毒素為具有疏水性脂多醣體（Lipopolysaccharide，LPS）的小分子，分子量約為10 kDa。生物體毒性反應主要來自脂質部分（Lipid A）。當內毒素（脂多醣體分子）進入動物體血液或身體組織中時，脂多醣體會啟動體內的各種免疫反應，產生發燒、白血球數目改變、彌漫性血管內凝血反應、低血壓、休克，甚至死亡等非特異性的生理病理反應。即使少量的內毒素也會導致大多數的哺乳動物死亡^[2，3]。

內毒素為高度熱穩定性分子，煮沸30 min仍無法破壞其穩定性，超氧化物、過氧化物和次氯酸鹽（漂白水）等強氧化劑可將其分解。由于內毒素具高度熱穩定性，同時亦具有良好的化學穩定性，因此須使用強氧化劑才可將其分解；然而膠原蛋白不論是在高溫處理或是強氧化劑的反應后，皆會產生變性現象，因此膠原蛋白并不適用此類方法去除所含內毒素。目前，去除膠原蛋白中內毒素的方法為：在膠原蛋白萃取純化過程中采取全程無菌操作及嚴密的無菌控管，以制備出無內毒素的膠原蛋白；另可在膠原蛋白萃取后以不同分子量過濾膜過濾內毒素與膠原蛋白；或以離子交換法去除膠原蛋白中的內毒素^[4-6]。上述方法均能將內毒素從膠原蛋白溶液中移除，但實驗成本相當高，使得低/無內毒素的膠原蛋白價格居高不下，限制膠原蛋白的發展及應用。此外，有研究利用脂多醣體分子中的Lipid A基團， 以脂質吸附進行包覆以形成微胞，進而將內毒素移除^[7，8]，但此分離方法不適用于去除內毒素膠原蛋白材料的大量生產。

本研究利用凝集素分子對于醣類分子專一吸附特性，對內毒素結構中的多醣類成分進行吸附，以除去膠原蛋白溶液中所含內毒素。凝集素是一種對醣類具有高度特異性的醣類接合蛋白^[9，10]。在免疫技術中常利用凝集素辨識細胞膜上特定醣蛋白結構。凝集素具有多價結合能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結合，因此常作為研究細胞膜上特定醣基的探針，或是應用于分離純化具有重要生物功能的醣類。不同凝集素對特定醣基具有專一性的結合能力，如小麥凝集素對N乙酰葡萄糖胺有特異性結合能力，在內毒素脂多醣體分子中含有N乙酰葡萄胺，因此或可利用凝集素進行N乙酰葡萄胺吸附以除去內毒素。本研究最終目標是以凝集素去除膠原蛋白溶液中內毒素，并進一步將嫁接凝集素玻璃球填充于管柱內部，利用管柱分離法去除膠原蛋白溶液中內毒素，建立有效、操作簡單且成本低廉去膠原蛋白溶液內毒素裝置，從而大幅降低低/無內毒素膠原蛋白制造成本，提升膠原蛋白產品整體應用的成效。

2實驗部分

2.1膠原蛋白萃取與純化

于4 ℃，將牛皮除毛，以0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液沖洗干凈，將牛皮剪成約0.5 cm×0.5 cm的碎片；以0.15 mol/L NaCl、50 mmol/L Tris緩沖液 （pH 7.4）清洗后，將其置入0.5 mol/L醋酸溶液中，以均質攪拌機打碎，使膠原蛋白從牛皮組織中溶解出來；加入0.5 g/L胃蛋白酶作用16-24 h后，高速離心溶有膠原蛋白的醋酸溶液，收集上清液；加入2.5 mol/L NaCl于上清液中進行鹽析，待靜置16-24 h后，再進行高速離心，收集沉淀膠原蛋白；將膠原蛋白沉淀物以50 mmol/L Tris 緩沖液透析，去除鹽分，將其溶于含1 mol/L NaCl、50 mmol/L Tris緩沖液中，靜置16-24 h后進行高速離心，收集上清液；加入1.8 mol/L NaCl于上清溶液中，以均質機攪拌均勻后靜置16-24 h，高速離心后收集上清液；純化后膠原蛋白醋酸溶液中于

Symbolm@@ 20 ℃低溫下保存，待使用時以pH 7.2磷酸鹽緩沖溶液于4 ℃下透析至中性。

2.2玻璃球凝集素吸附劑設計與制備

采用小麥凝集素作為去除內毒素吸附劑，先以H2SO4H2O2（3∶1，V/V）蝕刻玻璃球（直徑0.5 cm） 4 h，先使玻璃球表面產生氫氧基，接著加入以胺基硅烷第10期黃忠發等： 利用凝集素修飾的二氧化硅玻璃球去除膠原蛋白中的內毒素

2.3內毒素移除分析

內毒素移除測試分析先采用類似內毒素結構多醣體醣蛋白作為測試樣品。內毒素含量檢測則使用內毒素含量檢測試劑CAPE COD， （Kit no：XP0202，USA）。內毒素濃度測定采用LAL（Limulus amebocyte lysate）凝膠終點呈色法。LAL試劑與內毒素反應形成黃色的凝膠，于酶聯免疫吸附分析儀（Enzymelinked immunosorbent assay， ELISA reader）[TS（]圖1第一型膠原蛋白電泳圖

Fig.1SDSPAGE of purified type I collagen[HT5][TS）]波長405 nm下測得吸光值，再與標準溶液所測吸光值比較后，即可測得內毒素含量濃度。在不同的凝集素濃度、膠原蛋白溶液及溫度條件下，測試玻璃球凝集素吸附劑移除內毒素效能。

3結果與討論

3.1膠原蛋白萃取純化

第一型膠原蛋白的分子量約為283 kDa，由兩條含有1056個胺基酸的α1，以及一條含有1029個胺基酸的α2組合而成。SDSPAGE電泳實驗（圖1）表明，本研究萃取純化的膠原蛋白產物具有較高的純度。

3.2玻璃球凝集素吸附劑表面元素分析

[TS（]圖3表面元素分析結果（A）未處理玻璃球表面；（B）經酸蝕后玻璃球表面；（C）經胺基硅烷胺化后玻璃球表面及（D）嫁接凝集素玻璃球表面

Fig.3ESCA analyses of （A） untreated silica bead， （B） acid etched silica bead， （C）aminated silica bead and （D） lectingrafted silica bead[HT5][TS）]

3.3凝集素濃度對內毒素吸附的影響

以玻璃板為進行測試（表1），利用不同濃度凝集素（1， 2和5 g/L）與胺化后玻璃板表面反應，所制

成玻璃板凝集素吸附劑均能有效吸附膠原蛋白溶液（濃度為0.5g/L）內所含內毒素，內毒素含量由2.14×105 EU降低至10

Symbolm@@ 2-10

Symbolm@@ 3 EU間，其內毒素吸附率可達 99%。考慮制造成本，在后續的凝集素嫁接改質上均采用濃度為1 g/L凝集素進行制備。

3.4玻璃球凝集素吸附劑吸附內毒素測試

為測試玻璃球凝集素吸附劑吸附內毒素效率，利用2 g/L膠原蛋白溶液進行不同玻璃球顆數（提供不同吸附表面積）及不同體積膠原蛋白溶液內毒素吸附測試（表2）。結果表明，未經吸附處理膠原蛋白溶液內所含內毒素濃度為 2.34×108 EU，當玻璃球數目固定在30顆玻璃球時，嫁接在其上的凝集素能吸附8.4 mL膠原蛋白溶液中內毒素，其內毒素可降低至2.80×10

Symbolm@@ 3 EU。但當膠原蛋白溶液體積再增加時，其內毒素吸附效果卻急劇下降，表明所嫁接凝集素均已吸附上內毒素。當膠原蛋白溶液體積固定在6 mL時，可發現70顆玻璃球吸附后，內毒素濃度為3.06×10

Symbolm@@ 5 EU，因其可提供較多大的接觸面積，所以吸附效果提升。

由于不同濃度膠原蛋白溶液其內毒素含量均會不同，且膠原蛋白溶液黏度亦隨濃度增加而增加，此黏度的增加會影響膠原蛋白溶液內內毒素與凝集素接觸的機會而降低吸附效率。對1 mL的5和6 g/L膠原蛋白溶液進行內毒素吸附前后比較（表3）。嫁接上凝集素玻璃球雖能降低濃度6 g/L膠原蛋白溶液內毒素含量，由3.01×109 EU減少至2.39×105 EU，但其內毒素含量很高，顯示在高濃度膠原蛋白溶液內毒素去除上仍有限制。

通常，膠原蛋白在萃取純化過程中均需于4 ℃的低溫環境下進行，若環境溫度超過4 ℃時，所萃取純化后膠原蛋白便會開始重組產生纖維的型態。本研究在不同環境溫度下測試了凝集素吸附內毒素效率。在此實驗中是以類似內毒素成份多醣體的醣蛋白作為測試樣品，凝集素在室溫25 ℃及 4 ℃的低溫環境下也具有極佳內毒素吸附效果，顯示凝集素內毒素吸附效果較不受溫度的影響。

4結論

膠原蛋白的純化及保存不易，限制了膠原蛋白于臨床上的應用。在膠原蛋白萃取并純化過程及內毒素含量測定后，進一步研究出簡單、方便、易操作的去除內毒素方法，以有效縮短低內毒素膠原蛋白產品的成本，期望能發展出低內毒素的膠原蛋白材料。

本研究利用二氧化硅玻璃球為吸附內毒素載體，通過酸蝕令其表面形成OH基團，并以胺基硅烷進行胺化，令其表面產生具反應性胺基。其后利用EDC活化凝集素羧基，并利用NHS穩定活化區，最后再將凝集素與反應性胺基二氧化硅玻璃球載體作用，即可將凝集素固定于其上。采用ESCA進行表面元素分析，亦可確定凝集素成功嫁接于二氧化硅玻璃球載體上。探討不同凝集素及膠原蛋白濃度對于內毒素吸附效率影響，利用不同濃度凝集素（1.0， 2.0和5.0 g/L）與胺化后二氧化硅玻片表面反應，各組均能有效吸附膠原蛋白溶液內所含內毒素（達99%以上內毒素吸附率），顯現凝集素對于內毒素吸附效率甚佳，僅需低濃度凝集素即可得高吸附效率；而膠原蛋白溶液黏度隨濃度增加而遞增，該粘度變化會影響膠原蛋白溶液內內毒素與凝集素接觸的機會而降低吸附效率。嫁接于三維立體玻璃球載體凝集素因其可提供較多接觸面積，故隨著膠原蛋白體積量增加，仍可維持高吸附效率，顯示立體圓球型態由于其球體間接觸面積與碰撞機率增加，對于其上凝集素吸附內毒素效能有顯著裨益。未來可更進一步利用管柱分離操作原理，將嫁接凝集素玻璃球填充于管柱內部，設計一針對膠原蛋白中內毒素特異蛋白質醣類進行吸附系統，建立有效、操作簡單且低成本的去膠原蛋白溶液內毒素裝置，進而提升膠原蛋白產品整體應用的成效。

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