超高效液相色譜電噴霧離子化四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜指紋圖譜檢測(cè)毒蕈中4種鵝膏肽類(lèi)毒素

1 引 言

毒蘑菇又稱(chēng)毒蕈，是指含有不同類(lèi)型毒素的大型真菌。由于有些毒菌和食用菌的宏觀特征沒(méi)有明顯區(qū)別，且至今還沒(méi)有找到快速可靠的毒蘑菇形態(tài)鑒別方法，因而人們誤食毒蘑菇而引發(fā)中毒的事件時(shí)有發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在歐美、日本等國(guó)普遍發(fā)生的蘑菇中毒事件中，95%是由鵝膏菌屬引起的。廣東是國(guó)內(nèi)發(fā)生毒蘑菇中毒事件較多的省份之一，初步統(tǒng)計(jì)，廣東毒蘑菇有112 種，引起中毒的同樣是鵝膏菌屬（Amanita），有20 種，其中主要有灰花紋鵝膏、致命鵝膏和黃蓋鵝膏白色變種等＼[1＼]。鵝膏菌中引起中毒的毒素主要是鵝膏肽類(lèi)毒素，可分為鵝膏毒肽（Amatoxins）、鬼筆毒肽（Phallotoxins）和毒傘肽（Virotoxins）三類(lèi)。鵝膏毒蕈中的這三類(lèi)毒素均屬環(huán)肽類(lèi)中分子物質(zhì)，參與毒素組成的氨基酸大多是非蛋白質(zhì)氨基酸。鵝膏毒肽是一種雙環(huán)八肽，已分離純化的有9種＼[2＼]，其中α鵝膏毒肽（αAmanitin）和β鵝膏毒肽（βAmanitin）在鵝膏蕈中含量最高，且毒性最強(qiáng)，是鵝膏蕈中毒的主要原因。鬼筆毒肽是一種雙環(huán)七肽，已分離鑒定出的鬼筆毒肽類(lèi)毒素有7種＼[2＼]，主要有二羥鬼筆毒肽（phalloidin）和羧基二羥鬼筆毒肽（phallacidin）。毒素分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。鵝膏肽類(lèi)毒素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，耐高溫、耐干燥和酸堿，一般的烹調(diào)加工不會(huì)破壞其毒性，該類(lèi)毒素易溶于甲醇、乙醇、液態(tài)氨、吡啶和水。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的毒蕈毒素的質(zhì)譜聯(lián)用方法主要有液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)3種毒蕈毒素的測(cè)定＼[3＼]，毛細(xì)管電泳四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法分析5種毒蕈毒素含量＼[4＼]，液相色譜多級(jí)線性離子肼質(zhì)譜法測(cè)定1種毒蕈毒素＼[5＼]，超高效液相色譜四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測(cè)3種毒蕈毒素含量＼[6＼]，超高效液相色譜四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定5種毒蕈毒素含量＼[7＼]，以及基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù) （MALDITOF）對(duì)3種毒蕈毒素進(jìn)行鑒定＼[8＼]。這些報(bào)道主要側(cè)重于毒素定量測(cè)定方法的研究，分析數(shù)據(jù)以普通分辨率和一般質(zhì)量精度的四級(jí)桿質(zhì)譜或離子肼質(zhì)譜技術(shù)為主，或是單級(jí)飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF）數(shù)據(jù)，在應(yīng)用高分辨串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行定性鑒定分析方面還鮮見(jiàn)報(bào)道，也未見(jiàn)有系統(tǒng)的關(guān)于質(zhì)譜指紋圖譜應(yīng)用于毒蕈毒素鑒定方面的文獻(xiàn)。超高效液相色譜電噴霧離子化四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLCESIQTOF）可以精確測(cè)定鵝膏肽類(lèi)毒素分子離子及其同位素的質(zhì)量數(shù)和豐度比例，結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜的分子結(jié)構(gòu)碰撞裂解特征分析，在對(duì)未知化合物的分析鑒定方面比一般液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)要更為精準(zhǔn)和可靠。色譜和質(zhì)譜指紋圖譜能夠反映化合物的特性，在突發(fā)事件中毒檢測(cè)鑒定中具有極重要的作用。

本研究采用UPLCESIQTOF技術(shù)，建立了蘑菇菌樣品中α鵝膏毒肽、β鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽4種毒素特征信息的高分辨質(zhì)譜指紋圖譜和分析鑒定方法，方法快速、準(zhǔn)確、選擇性好、特異性強(qiáng)，為毒素的定性確證提供了一種可靠方法，適用于突發(fā)毒蕈中毒事件的毒素確證分析。2 實(shí)驗(yàn)部分