櫸樹組培芽繼代增殖的影響因素

張日清，劉海龍,2，汪靈丹，金曉玲

（1.中南林業科技大學a.林學院；b.風景園林學院，湖南 長沙 410004；2.廣西壯族自治區林業科學研究院，廣西 南寧 530002）

櫸樹Zelkova schneideriana屬于榆科櫸屬，落葉大喬木，國家二級保護植物，分布于我國淮河流域、秦嶺以南的長江中下游地區。櫸樹材質優良，是生產各類高檔家具和工藝品的上等木材，同時櫸樹也是深受人們喜愛的傳統色葉園林風景樹種[1-3]。

由于櫸樹用途廣泛，現階段已被過度采伐，因此目前櫸樹資源非常緊缺。植物組培技術是對植物進行繁育與保育的一種重要技術手段。特別是利用芽器官的以芽繁芽技術是當前組培工廠化育苗的常用技術手段，被廣泛應用于桉樹、香蕉等苗木的大規模繁育[4-5]。

櫸樹的芽器官繁殖技術，前人已經有了大量的研究報告。金曉玲[6-7]經研究發現，櫸樹組織誘導和繼代培養中，生根的最適培養基為WPM培養基。實生苗幼嫩莖段在WPM＋BA1.0 mg/L培養基上直接形成叢生芽。汪靈丹等[8]研究發現，櫸樹最佳增殖培養基是WPM＋4.0 BA mg/L，最大增殖系數為15。

櫸樹組培繼代增殖技術是櫸樹芽器官繁殖技術的關鍵，得到大量健康的叢生芽是實現櫸樹組培工廠化育苗的前提。筆者在前人研究的基礎上，研究影響櫸樹組培繼代芽增殖效果及生長狀況的幾種因子，以期獲得更多更健壯的組培繼代增殖芽進入生根培養階段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉入繼代增殖培養的材料共有4種來源。第1種：以櫸樹幼嫩莖段為外植體，經過初代誘導腋芽培養后，取試管腋芽叢生芽中的單個芽為試驗材料（見圖1）。第2種：櫸樹幼嫩的頂芽經過消毒后存活，從初代培養基轉入繼代增殖培養階段（見圖2）。第3種：櫸樹幼嫩莖段，經過初代誘導腋芽培養后，取試管腋芽單芽為試驗材料（見圖3）。第4種：對櫸樹種子進行無菌播種，發芽后直接剪取萌發芽轉入繼代增殖培養階段[9]（見圖4）。

圖1 試管腋芽叢生芽Fig.1 In vitro clustered shoots from axillary bud

圖2 幼嫩的頂芽Fig.2 A tender terminal bud

圖3 試管腋芽單芽Fig.3 A shoot in vitro from axillary bud

圖4 無菌播種的萌發芽Fig.4 A bud obtained through aseptic seeding

1.2 繼代增殖培養的試驗方案

1.2.1 基本培養基及植物激素對繼代增殖效果的影響

為了更準確詳細地研究櫸樹繼代培養的增殖問題，采用4因素3水平L9(34)正交設計方案進行試驗設計（見表1）。取大小一致的無菌芽苗，苗高約1.0 cm，每組接種10瓶，每瓶接種1株，每個處理重復2次。基本培養基設置3個水平：A1（MS）、A2（WPM）、A3（改良MS）。NAA設置3個水平：B1（0 mg/L）、B2（0.5 mg/L）、B3（1.0 mg/L）。KT設置3個水平：C1（0 mg/L）、C2（1.0 mg/L）、C3（2.0 mg/L）。BA設置3個水平：D1（0 mg/L）、D2（1.0 mg/L）、D3（4.0 mg/L）。

1.2.2 抗氧化劑和吸附劑抑制褐化的效果

對比活性炭（AC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、抗壞血酸（Vc）三者在櫸樹繼代增殖培養過程中的抗褐化能力的強弱以及對生長的影響。AC 2.0 g/L，PVP 2.0 g/L，Vc 15 mg/L，每個處理15瓶，留15瓶作為空白對照。培養基選用WPM＋BA 1.0 mg/L，培養基中添加瓊脂4.0 g/L，蔗糖30 g/L，pH值調至5.8。

1.2.3 材料來源對繼代增殖效果的影響

針對櫸樹繼代增殖培養過程中，芽體愈傷化現象嚴重這一問題，對比4種來源材料的愈傷產生情況，研究不同材料的適宜增殖方法。

表1 繼代增殖試驗設計方案L9(34)Table 1 The orthogonal test L9(34) plan of multiplication of subculture buds mg·L-1

2 結果與分析

2.1 基本培養基及植物激素對繼代芽增殖效果的影響

將第1種來源的材料，即誘導萌發的腋芽叢生芽，自基部切離，接種到繼代培養基上，每處理接種10瓶，每瓶接種1株，每處理重復2次。培養35 d后，調查統計芽增殖及生長情況，結果見表2。

采用直觀分析法，對芽增殖倍數這個指標進行分析。影響增殖倍數的指標從主到次為：BA（極差3.90）、KT（極差1.10）、NAA（極差0.67）、基本培養基（極差0.63）。方差分析結果顯示：4個因素中因素D（BA）達到顯著水平（F＝32.819＞F0.05＝19.000）。均值（k）表明，最優組合為A2B2C3D3，即WPM＋NAA 0.5 mg/L＋KT 2.0 mg/L＋BA 4.0 mg/L培養基，但本試驗中不含該組合，因為正交試驗是一種均一性試驗設計，不可能含所有處理組合[10-11]。但根據表1仍可選出較好的處理組合A1B3C3D3，即MS＋NAA 1.0 mg/L＋KT2.0 mg/L＋BA 4.0 mg/L，也可達較好的增殖效果，增殖率為5.5。

表2 培養35 d時芽平均增殖倍數和芽長Table 2 Bud proliferation coefficient and length after 35 days

采用直觀分析法，對芽長這個指標進行分析。影響芽長的指標從主到次為：NAA（極差0.867）、KT（極差0.733）、基本培養基（極差0.466）、BA（極差0.400）。方差分析結果顯示：4個因素均未達到顯著水平。均值（k）表明，最優組合為A2B3C3D1，即WPM＋NAA 1.0 mg/L＋KT 2.0 mg/L培養基，櫸樹繼代芽可以達到較好的抽長效果。

2.2 抗氧化劑和吸附劑抑制褐化的效果

在培養基中加入抗氧化劑或活性炭，對防止某些植物培養物的褐變具有一定的效果。3種抗氧化劑和吸附劑抑制繼代芽褐變的效果見表3。結果表明，2.0 g/L PVP具有良好的抑制繼代芽褐變的作用，加入該物質后，繼代芽幾乎無褐化現象發生。即使偶爾出現少量褐化，也只發生在葉片，對芽體生長無明顯損害。15 mg/L Vc對繼代芽褐化無明顯抑制作用。而添加2.0 g/L AC，也對繼代芽的褐化無抑制作用（見圖5），芽體在添加活性炭的培養基中褐化，繼代芽在添加活性炭的培養基中前期生長健康，葉片顏色轉為深綠色，但培養15 d后繼代芽會出現明顯玻璃化的現象（見圖6）。

表3 抗氧化劑和吸附劑的防褐化效果?Table 3 Inhibition effect of antioxidants or adsorbents on browning

圖5 芽體褐化Fig.5 Bud browning

圖6 芽體玻璃化Fig.6 Bud vitri fication

2.3 材料來源對繼代芽增殖效果的影響

第1種來源的材料（即試管腋芽叢生芽），由于在初代培養時能吸收來自母株莖段的大量營養，因此生長健壯，木質化程度較高。這類材料可使用WPM＋NAA 0.5 mg/L＋KT 2.0 mg/L＋BA 4.0 mg/L培養基，獲得高的增殖系數。

第2種來源的材料（即幼嫩的頂芽），該材料直接來自母株，大多數頂芽由于過于細嫩，在消毒時易被殺死，因此得到這類芽的幾率較小，這類芽在添加BA的培養基上極易出現愈傷化，愈傷化能導致整個芽體被包埋而死亡（見圖7）。因而，這類芽不適宜在添加BA的培養基上培養，使用KT代替BA，雖然增殖系數降低，但避免了愈傷化現象的發生，保證了繼代芽的健康生長。

第3種來源的材料（即試管腋芽單芽）和第4種來源的材料（即無菌播種的萌發芽）同第2種材料，芽較細弱，使用KT代替BA，能取得較好的繼代培養效果，芽健壯（見圖8）。第2種、第3種和第4種來源的材料經過數代繼代增殖培養后，芽體木質化程度逐漸增強，可轉入添加BA的培養基中。

圖7 頂芽愈傷化Fig.7 Terminal bud with callus formation

圖8 無菌播種的萌發芽產生增殖芽Fig.8 Proli firation bud from plantlet after aseptic seeding

3 結論與討論

活性炭是吸附性較強的無機吸附劑，但它并沒有選擇性，在吸附酚類物質的同時，也把培養基中的營養物質吸附掉，短時間內對培養物沒有影響，時間長了外植體就因缺少營養而枯死[12]。前人分析凡是能夠鈍化多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）等酶系統活性的抗氧化劑，理論上都具有阻礙或防止外植體褐變的作用[13]。但某些抗氧化劑（如Vc）不耐高溫。而PVP是酚類物質的專一吸附劑[14-15]，且耐高溫，選擇PVP作為防止褐變物質從理論上是可行的。本試驗中選用了PVP控制櫸樹組培繼代芽褐變，取得了顯著效果。

前人已經對櫸樹組培做過大量研究。但大多數研究者并沒有提到愈傷化的現象。筆者通過研究發現，櫸樹組培繼代增殖過程中的愈傷化嚴重危害櫸樹組培繼代芽的健康生長。KT可以在前幾代繼代培養過程中暫時替代BA，不產生愈傷的同時，取得一定的增殖效果。但其作用并不穩定，即有時可以取得3倍甚至4倍的增殖效果，有時又不發生增殖。因而KT的增殖效果在穩定性上較BA差，在后期繼代培養過程中KT不能完全代替BA。

觀察發現：木質化程度高的繼代芽在繼代增殖過程中不易產生愈傷。因此通過各種途徑提高組培繼代芽的木質化程度至關重要。基本培養基、光照、溫度、瓊脂等都是優化的對象，如果能迅速提高組培繼代芽的木質化程度，則能避免愈傷的產生，從而大幅度提高櫸樹繼代增殖的效率。

后續的研究中發現，用IBA替代NAA或者直接去掉培養基中的生長素，可以減緩愈傷組織的產生，而對櫸樹組培繼代培養的增殖倍數等重要參數不產生明顯影響。因而后期的繼代增殖培養基中只采用BA和KT的組合作為生長調節物質。

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