花生接種膠凍樣類芽孢桿菌對土壤微生物群落、氨化細菌、固氮菌及產量的影響

張愛民， 甄麗娜， 徐業營， 張雙鳳， 張璐琳

(1.河北大學生物技術研究中心 河北保定 071051； 2.博野縣農業農村和水利局 河北保定 071300； 3.河北邢化生態環境工程有限公司 河北寧晉 055550)

0 前言

花生是全球種植較廣泛、用途多樣的油料和蛋白作物，也是我國高商品率的主要經濟作物和特色出口農作物，綜合加工利用增值明顯，是促進農業可持續發展的主導作物之一。花生生產對維持我國油脂和蛋白質的供需平衡，保持社會經濟的健康發展具有重要的現實意義[1]。

河北省花生年均播種面積近650萬畝，總產量1 400 kt，分別占省內油料作物的70%和90%以上，是河北省第一大油料作物，播種面積和總產量均占全國花生的10%。由于多年連作，土壤生物肥力下降，土傳病害嚴重，根際微生物代謝紊亂，直接抑制根的營養吸收和生長，同時也影響根圍土壤中的物質轉化，從而在很大程度上影響花生的生長和產量，研究種植區域接種功能微生物對微生物群系的變化和花生產量的提高具有重要的意義[2]。

膠凍樣類芽孢桿菌K-9菌株是河北大學從河北省高陽縣玉米根際土壤中分離篩選出的土著微生物菌株，是一種能分解磷鉀礦物的細菌，還具有分解土壤中硅酸鹽、鋁酸鹽及云母等礦物質，釋放鉀、硅、磷等多種營養元素供作物吸收利用，增加作物產量的作用。該菌株作為我國生物肥料生產的一類重要功能菌，用于轉化利用土壤中的礦物質元素等資源，已在國內眾多微生物肥料生產企業中得到應用，對于發展生態、經濟農業具有十分重要的意義[3-4]。

本研究以膠凍樣類芽孢桿菌K-9菌株為出發菌株研制的菌粉為接種劑進行花生接種試驗，分析在花生不同生育期根際土壤中細菌、放線菌、真菌等三大類微生物數量的變化，重點研究了與土壤氮素相關的氨化細菌及固氮菌數量的變化，在分析影響接種后花生產量的基礎上，探索出了提高花生產量的施肥措施。

1 試驗材料及方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗地點概況

試驗地點選在河北省河間市冀宇農業專業合作社的花生地，位于北緯38°28″、東經116°24″，海拔高度12.1 m，雨季主要集中在7—8月，年降雨量450～900 mm，屬于溫帶半濕潤季風氣候區。供試土壤為沙壤土，試驗前0～20 cm土層的基本理化性狀見表1。

表1 供試土壤基本理化性狀

1.1.2 試驗肥料

過磷酸鈣，w(P2O5)≥12%，湖北程瑞化學有限公司；尿素，w(N)≥46%，滄州大化集團有限公司；磷酸氫二銨，N-P2O5-K2O=18-46-0，什邡志信化工有限公司；硫酸鉀，w(K2O)≥50%，濟南邦瑞化工有限公司；膠凍樣類芽孢桿菌K-9菌株菌粉(100億/g，以下簡稱菌粉)，河北大學生物技術研究中心生態與環保實驗室研制。

1.1.3 作物

花生：冀農08-12，河北農業大學農學院國家花生協作組提供。

1.1.4 培養基

細菌檢測培養基(牛肉膏蛋白胨培養基)：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH為7.2～7.4。

放線菌檢測培養基(改良高氏1號培養基)：可溶性淀粉20.0 g，硝酸鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈉0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水l 000 mL，pH為7.2～7.4。

真菌檢測培養基(馬丁氏培養基)：葡萄糖10.0 g，蛋白胨5.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，瓊脂20.0 g，10 g/L孟加拉紅溶液3.3 mL，硫酸鎂0.5 g，自來水1 000 mL，pH為7.0～7.4；使用前每l00 mL培養基中加1 g/L鏈霉素0.3 mL。

固氮菌檢測培養基(無氮培養基)：磷酸二氫鉀0.2 g，硫酸鎂0.2 g，氯化鈉0.2 g，硫酸鈣0.1 g，碳酸鈣5.0 g，葡萄糖或甘露醇10.0 g，蒸餾水l 000 mL，pH為7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

花生種植時間為2019年4月24日，收獲日期為9月26日，生育期125 d。采用隨機區組設計，設4個處理，以A1處理為對照，每個處理重復3次，試驗各處理的肥料用量見表2。小區面積為7.5 m2，采用地膜覆蓋種植模式，人工點種，種植密度18 000株/畝。肥料施用方法為底施，即將各種肥料混合均勻后撒施在小區中，然后翻耕定植花生。整個生育期澆水4次、除草2次。

表2 試驗各處理的肥料用量 g/畝

1.2.2 土壤樣品采集

在花生出苗期、開花期、結莢期和收獲期進行土樣采集。采用5點取樣法采集土樣，土層深度為5～20 cm，采集后剔除土樣中的雜物，破碎大土塊，置于通風條件下自然風干，風干后的土壤樣品用研缽磨碎，過1 mm篩子后用塑封袋封閉，于4 ℃下保存待測。

1.2.3 土壤微生物的測定

細菌、放線菌和真菌采用平板稀釋法[5]進行測定，細菌測定選用牛肉膏蛋白胨培養基，真菌測定選用馬丁氏培養基，放線菌測定選用改良高氏1號培養基。

采用最大可能數(MPN)法測定土壤樣品中的氨化細菌，采用無氮培養基法測定固氮菌。

1.2.4 花生收獲期生育性狀及產量的測定

在花生收獲期，分別取A1、A2、A3、A4等4個處理的10穴花生進行株高、側枝長度的測量及莢果數和產量的測定，其中株高和側枝長度采用米尺測量，花生風干后采用FA1004型天平(上海衡平儀器廠)稱量其質量，并采用SPASS軟件進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 不同施肥處理對土壤中細菌、放線菌和真菌數量的影響

分別在花生苗期、開花期和結莢期，通過平板稀釋法，選用不同的培養基對土壤中的細菌、放線菌和真菌數量進行3次平行測定，測定結果的平均值見表3。

表3 花生不同生育期土壤中細菌、放線菌和真菌數量測定結果的平均值

從表3可以看出，土壤中細菌數量最多，達到108數量級；放線菌數量次之，為106數量級；真菌數量最少。

花生生育期從苗期到開花期，細菌的繁殖呈現上升趨勢，到結莢期則出現下降。施用膠凍樣類芽孢桿菌處理的細菌數量與A1處理的相比均有不同程度的增加，其中A4處理的在苗期增加17.0%，開花期達到最大為25.6%，到結莢期又略有下降。放線菌數量的變化與細菌的相同，與A1處理的相比，A4處理的放線菌數量在苗期增加7.2%，開花期達到最大為18.7%，到結莢期又略有下降。土壤中的真菌與細菌、放線菌不同，隨花生生育期的延長，3個時期的真菌數量均表現出A2>A4>A3，A3處理的真菌數量最少，可能與膠凍樣類芽孢桿菌對土壤病原微生物具有抑制作用有關，而土壤中的致病微生物大多為真菌[6-7]。

2.2 不同施肥處理對土壤固氮菌和氨化細菌數量的影響

在花生的不同生育期采集土樣，通過平板稀釋法，采用氨化細菌的檢測方法對土壤中的氨化細菌數量進行分析，同時選用固氮菌培養基對土壤中固氮菌數量進行測定，結果見表4(其中“+”表示可檢測出，“-”表示未檢出)和表5。

表4 花生不同生育期土壤中氨化細菌測定結果

表5 花生不同生育期土壤中固氮菌測定結果 cfu/g

氨化作用在土壤氮素礦化中起到了決定性作用，其強度的變化在一定程度上反映了土壤供氮能力[8-9]。由表4可知，花生在苗期和開花期，A1處理檢測不出氨化細菌，到花生結莢期可以檢測出氨化細菌；而A4處理從花生苗期到收獲期，均可檢測出氨化細菌，可能是菌粉接種量大，誘導了土壤中氨化細菌的活動，機理還有待研究。由于氨化細菌檢測只進行了定性分析，無定量的比較，所以各處理間無法進行數量的統計。

2.3 收獲期花生生育性狀調查及考種

花生收獲時，首先在A1、A2、A3、A4等 4個處理中選取相同的位置取10穴花生，進行產量測定，同時進行考種，然后通過SPASS軟件進行數理統計分析。不同施肥處理的花生生育性狀及產量測定結果見表6。

表6 不同施肥處理的花生生育性狀及產量測定結果

由表6可知，A1、A2和A4處理的花生株高、側枝長度和產量均呈現遞增趨勢，A3處理的側枝長度略短，A4表現最好，4個處理的花生單株莢果數基本無差異。進一步通過SPASS軟件進行花生株高、側枝長度、單株莢果數及產量的顯著性分析，差異顯著性(P顯著性)依次為0.838、0.990、0.172、0.902，均大于P(P=0.05)，說明處理間無顯著性差異，表明通過減少過磷酸鈣及硫酸鉀的用量、增加菌粉的用量可以達到花生增產的效果。畝施菌粉200 g同時每畝減少5 kg過磷酸鈣和1 kg硫酸鉀用量的A2處理的花生產量與A1處理的相比，無顯著差異，說明畝施菌粉200 g與畝施5 kg過磷酸鈣和1 kg硫酸鉀具有等效性。進一步提高菌粉接種量同時減少化肥用量，A4處理的花生產量與A1處理的相比增產46.4 kg，進一步證明了施用膠凍樣類芽孢桿菌具有增產效果，可減少化肥用量。

2.4 經濟效益分析

花生收獲后，按尿素2 650元/t、磷酸氫二銨3 600元/t、過磷酸鈣700元/t、硫酸鉀4 250元/t、花生4.4元/kg、菌粉40元/kg計，進行經濟效益分析，結果見表7。

由表7可知：A2、A3、A4處理與A1處理比較，畝新增純利潤分別為130.87、165.86、214.91元，表明逐漸減少化肥用量的同時增加菌粉用量，畝產量和產值呈上升趨勢；A4處理表現最佳，與A1處理相比，花生產量提高了12.24%，純利潤增加了214.91元/畝；施用菌粉可以作為花生減施化肥的基本措施，即畝施用菌粉400 g，在不減少尿素及磷酸二銨用量的前提下，過磷酸鈣和硫酸鉀的用量減少50%，可以達到理想的增產效果。

表7 經濟效益分析一覽表

3 結語

本研究表明，膠凍樣類芽孢桿菌作為花生接種劑對于減少化肥用量、提高花生產量具有一定的積極作用。由于試驗地塊單一，膠凍樣類芽孢桿菌的大田應用試驗效果有待進一步驗證，其對根際有益菌群增加的機理也有待進一步研究。