培養法和染色法對養殖環境中微生物氣溶膠濃度的檢測

劉暢

(鞍山市產品質量監督檢驗所，遼寧 鞍山 114006)

大氣氣溶膠當中，生物氣溶膠是其中具有活性的部分，包括細菌、真菌以及病毒等等，其以空氣為介質進行傳播和擴散，從而引發人類的急性、慢性疾病，例如傳染、中毒、過敏或者植物疾病的流行以及傳播。畜禽舍環境當中所產生的微生物氣溶膠不僅將對畜禽以及相關人員的健康帶來危害，同時也將對外界的環境帶來污染。許多重大畜禽類型的傳染病將是通過氣溶膠進行傳播的。

微生物氣溶膠濃度檢測可使用多種方法，傳統的方法是培養之后的菌落技術，當前，隨著分子生物學研究的進步，可使用DNA染色后直接鏡檢技術以及熒光原位雜交、定量PCR技術等等，當前最常用的是培養后的菌落技術，然而該方法無法對微生物的實際含量進行準確地計算，根據實際的報道可了解，僅有0.3%～10%的微生物能夠被培養。DAPI染色法已經被認定為標準的檢測浮游生物總量的方法，同時其操作較為簡便，能保證技術的準確性。

一 試驗材料以及試驗方法

1.采集樣品

本實驗分別對1個豬舍、2個雞舍、2個牛舍進行了檢測，通過將國際標準AGI-30空氣采樣器放置在畜禽舍的中間，使其離地約為1.0m，以50m l的無菌生理鹽水為采樣介質，采樣過程當中的氣流速度為12.5L/min，驅動時間為20min。在采樣的過程中同時對舍內的溫熱指標進行記錄。

2.培養計數法

取25ml空氣采樣液進行搖勻，而后將采樣液均勻分為三份，一份以包含有50mL/L綿羊血的營養瓊脂作為培養基，從而實現需氧細菌的培養，而另一份則依舊包含體積分數為5%的綿羊血的營養瓊脂作為培養基，從而實現厭氧細菌的培養。而第三份則以沙保弱作為培養基，從而實現真菌的培養，每個樣品重復三次。細菌在恒溫37℃的培養箱中培養24h～48h后開始計數，真菌在恒溫25℃的培養箱中培養3～7d后進行技術，校正之后用于生物氣溶膠濃度的計算。

3.DNA染色后計數

通過預先經過鉻酸浸泡以及高壓滅菌處理之后的25mL采樣液放入50mL玻璃瓶當中，隨后加入5mL福爾馬林，再加入7.5mL DAPI染液，而后將采樣液置于暗室中染色10min，最后在低于0.07大氣壓狀況下使用硝酸纖維濾膜抽濾采樣液，抽干之后取出硝酸纖維濾膜，將其置于滴上鏡油的載玻片上進行計數。每一個細胞代表一個微生物氣溶膠粒子。

二 試驗分析

1.DAPI染色后的計數結果

使用DAPI染色法所測試得出的不同養殖環境下的微生物氣溶膠濃度如下圖所示:

畜禽舍(編號)不同計數方法微生物的濃度AGI-30/(105 cfu/m3) DAPI染色(106 cell/m3) Median Max Min Median Max Min雞舍A 38.9 67.2 13.8 166 325 19.2雞舍B 27.1 43.3 14.7 166 275 8.90豬舍C 26.3 40.1 15.6 136 228 5.55牛舍D 2.09 3.08 1.14 8.36 15.7 0.93牛舍E 5.92 83.2 3.07 37.3 59.3 10.4

不同養殖環境下的微生物氣溶膠濃度為166×106、166×106、136×106、0.836×106、3.73×106個/m3空氣。通過在熒光顯微鏡下觀察可了解到，每個視野當中被染色的微生物最合適的數量為30～60個，過多或者過少都將導致計數產生偏差。由此，在顯微鏡觀察之前應將采樣液進行適當的稀釋，同時抽濾過程中選擇合適的樣品數量。

2.培養法測試得出的氣溶膠濃度

通過AGI-30采樣器對不同養殖環境內的微生物氣溶膠濃度檢測結果分別為采樣器對2個雞舍、1個豬舍和2個牛舍38.9×105cfu/m3、27.1×105cfu/m3、26.3×105cfu/m3、2.09×105cfu/m3、5.92×105cfu/m3。對于雞舍A、B而言，在經過AGI-30采樣器進行樣品的采集之后，培養計數法所測試得出的濃度僅僅占據DAPI計數法所得出濃度的2.34%和1.63%，豬舍C、牛舍D、E所培養得出的微生物濃度占DAPI染色計數法得出濃度的1.93%，2.50%和1.59%。

三 結論

對于復雜的介質而言，由于介質當中包括有使DNA粘連或者存在抑制酶反應的物質，從而導致DNA的克隆結果無法對真實的狀況進行反映，通過使用熒光定量PCR技術，能實現對特定微生物含量計量的技術，然而該技術對試驗操作人員的要求較高，試驗的成本也較高，該種技術可對已知的特定微生物的定量定型分析進行檢測。DAPI在染色后的直接熒光鏡計數操作較為簡單方便，無論是活細胞還是死細胞、殘核細胞都能清楚地檢測出來，從而得出了一個客觀真實的數據，是對某種環境下微生物總量檢測的較為便捷、快速有效的檢測方式。

在畜禽養殖環境下，微生物氣溶膠來源以及成分都較為復雜，不同的微生物種類所需要培養的條件以及營養的成分都各有不同，由此，通過傳統的培養方式能培養出的微生物的數量以及種類都十分有限，同時，即使可培養的微生物也不一定能全部培養成功。由此，傳統的培養方法僅僅只能在一定的條件下實現對微生物的檢測，難以對微生物的實際狀況進行分析和檢測，從而在很大程度上對試驗結果的分析和判斷造成了影響。

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