宏基因組技術及其在酶制劑中的應用

于 雷，于 麗，張 薇，陸麗麗

(吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

目前，酶法催化因其具有可常溫反應、反應速度快、催化作用專一、能夠在水相中催化等優點，已經逐漸成為國際綠色化學發展的重要趨勢之一。酶制劑作為生物催化劑廣泛應用在化工、醫藥和能源等產品的開發中[1]。酶催化劑與有機催化劑相比具有較強的催化能力，它能夠把一系列復雜的分子作為底物且反應速率是非酶催化反應速率的幾十甚至幾百倍。因此，人們構建出越來越多的酶分子催化工藝，以替代傳統高能耗和高污染的化學催化工藝，滿足人們對節能環保的需求。

“Metagenome”是由Handelsman等[2]于1998年提出的一個新名詞，其定義為特定生物環境中全部微小生物遺傳物質的總和，主要包括細菌和真菌。自然界中的微生物是生物催化劑的一個非常重要的來源，人們利用傳統的方法從環境樣本中分離新型酶主要是建立在純培養的基礎上，據估計通過純培養方法開發的環境微生物只占總量的0.1%～1%[3]。而生物環境中有多達99%以上的微生物是不可培養的。宏基因組是直接從環境樣本中提取總的DNA，利用合適的載體克隆至宿主細胞構建宏基因文庫，從中篩選新的目的基因及活性物質。此外，研究者們從一些具有極端pH值、極端溫度、低水分活度、高滲透性、高光照等極端條件的環境中分離出來具有了新型的框架及適應此棲息環境的特殊催化性能的酶。利用宏基因組技術對環境中DNA進行分離、歸檔和分析，以便更好地開發利用生物的多樣性，識別并了解它們的基因序列、蛋白質編碼序列甚至重建其代謝途徑。宏基因組的研究使人們擺脫了微生物不可培養的限制，揭示出更多新的生物學規律，同時也為人們挖掘微生物來源的新酶及活性小分子，提供更為強大的技術手段。本文通過對宏基因組技術的綜述，以期其在酶制劑研發方面得到更為廣泛的應用。同時利用宏基因組技術開發新酶為食品新產品研發奠定了基礎，為食品工業化生產開辟了一條新的途徑，必將推動食品行業的蓬勃發展。

1 宏基因組學概述

目前人們使用宏基因組技術手段，主要集中在兩方向的研究：一是增強人們對生物多樣性和環境微生物相互關系的認識；二是挖掘出新的酶(蛋白)大分子和小分子活性物質[4]。當今人們使用的大多數酶是從微生物細胞中提取的。除真核生物和單細胞酵母外，原核生物是酶蛋白的主要來源。原核生物(細菌和古生菌)是地球上出現最早和數量最多的生命形態，經歷了漫長的演變后為適應惡劣的環境從而具有了很強的適應特性，從中可以得到許多具有特殊催化功能的生物催化劑。但由于大多數原核生物不能夠被培養或暫時還沒有找到合適的培養底物從而使對其的開發利用受到了限制。宏基因組方法避免了一些微生物培養條件的限制，對不可培養微生物的基因進行提取、篩選與表達，不斷擴大自然界中基因樣本的數據空間，從中源源不斷地尋找出低同源序列的蛋白質，為新型生物催化劑的開發及篩選提供了一個廣大的資源庫。

1.1 宏基因組DNA提取技術

宏基因組DNA提取既要盡可能地大量提取樣本的基因組，又要保持片段的完整性和純度[5]。宏基因組DNA的提取方法主要有兩種：一種是原位提取法，該方法操作簡單所獲得的DNA較完整，并能很好地代表特定生物群落的多樣性[6]。但此方法常會出現細胞裂解不完全或由于機械剪切力較強，使DNA片段過小(一般為1～5kb)等問題。另一種是異位提取法，是利用物理方法將微生物從環境樣本中分離出來，再按純培養細胞的處理方法裂解微生物細胞提取DNA[7]。該方法獲得的DNA雜質少， DNA片段具有很好完整性(20～500kb)。但此方法不易提取一些細胞壁較厚的微生物DNA，并且DNA產率只是原位提取法的1%～10%[8]。對于酶主要來源的土壤宏基因庫來說，由于微生物與土壤粒緊密結合及腐植酸等抑制性物質的存在，很難從自然界中獲得高分子質量的eDNA。為此人們采用乙醇沉淀法去除土壤粒及腐植酸的干擾，使DNA析出從而得到純化的宏基因組DNA[9]。

1.2 宏基因組富集技術

全細胞的富集培養是利用適合的選擇培養基進行篩選，但由于優勢菌群的快速生長會競爭有限的營養，進而導致少數的“稀有”菌群的丟失。對此，人們采用先在嚴格條件下短時間處理，后改為較溫和的處理條件，在一定程度上可以克服這一局限性[8]。

穩定同位素探針(stable-isotope probing，SIP)利用13C-DNA檢測到的高活性生物群落較小，但被標志的DNA數量較少，利用標準的探針不易被檢測到。因此，賈仲軍[10]使用高靈敏的PCR技術，有效地檢測到大量在密度梯度離心中看不見的被標記的DNA片段。同時，分子指紋圖譜已經被用于判定不同浮力密度中13C-DNA的富集程度，從而獲得不同浮力密度DNA[11]。

抑制性消減雜交技術(suppression subtractive hybridization，SSH)是通過一次差減雜交使低豐度的序列(mRNA)得以高于1000倍的富集，從而有效地選擇擴增目標序列并抑制非目標序列的擴增[12]。

RT-RNA是通過減少單鏈核苷酸的降解，達到獲取完整DNA的方法。由于從環境樣本中直接提取的稀有微生物的相關DNA只占總DNA的較少比例，這會導致在后續的PCR操作中，優勢微生物目標基因偏嗜性擴增的出現。可以通過微生物均一化的方法來解決這一問題，即在氯化銫梯度離心時存入嵌入劑，如雙苯甲亞胺[13]。此外，稀有物種的DNA與大量的單鏈DNA相比產生雙鏈核酸的速度快。因此使變性斷裂的DNA片段在嚴格條件下重新退火，可以從雙鏈核酸中分出單鏈核酸從而使稀有微生物的基因序列得以富集[14]。

1.3 宏基因組文庫構建

常用的載體有質粒(plasmid)、細菌人工染色載體(BAC)、柯斯黏粒(Cosmid)、福斯黏粒(Fosmid)等[15]。質粒載體插入片段較小(＜10kb)而大片段DNA可以采用克隆效率高的Cosmid(35～45kb)、BAC(200kb)等載體[16]。同時由于外源基因的表達受宿主細胞的遺傳類型、細胞基質、細胞的生理狀態及初級代謝產物的影響，人們利用穿梭載體擴大宿主的范圍以便于促進和提高外源基因的表達[17]。

對于質粒型小插入片段的異源表達，應用雙向質粒表達載體可以明顯提高質粒型小文庫中DNA的表達水平，進而提高目標基因產物篩選的命中效率[18]。另外，對于原位裂解方式獲得的eDNA片段，為避免對其攜帶基因的再次破壞，末端補平或T-A連接的方式替代使用限制性內切酶方法可以提高宏基因組文庫的庫容[19]。

大腸桿菌由于生長迅速、遺傳背景清晰并且遺傳操作容易成為克隆外源基因的首選宿主。但是要使異源DNA插入片段成功地轉錄，要求宿主必須能夠識別內在的啟動子。而不良的表達會導致蛋白質錯誤的折疊或不溶。大腸桿菌因具有很少氨基酸的密碼子進而導致氨基酸不能正確排列成肽鏈或者被截斷。為此人們使用了噬菌體載體使具有特定活性的酶能夠在噬菌體菌苔上直接進行篩選[20]，或利用穿梭載體替代目標基因在宿主表達的DNA環境[21]。

1.4 宏基因組篩選

序列驅動的篩選方法(sequence-driven screening)需要根據已知基因或基因表達產物的保守序列設計探針和引物。這一要求導致許多新型基因不易被發現，甚至使2個共同進化的功能相似的基因也很難用“家族特異性”引物區分開來。由于對序列信息的依賴基因測序技術成為了序列驅動篩選的關鍵技術。當代最新的測序方法是由Pacific Biosciences公司推出的單分子實時DNA測序。第三代測序技術實現了DNA聚合酶內在自身的反應速度及自身的延續性，1s可以測序超過10個堿基，酶法測序速度是化學法測序的2萬倍，同時它的精度非常高，達到99.9999%[22]。而序列驅動的篩選方法一般只能獲取功能基因的片段得不到基因的全部序列[23]。目前，人們利用基因步移法(gene walking)對目的片段進行擴增，具體做法是利用擴增子作為標記探針去識別傳統宏基因組文庫中假定基因或利用PCR技術恢復基因上游或下游空白序列從而得到基因的全部序列[18]，生秀杰等[24]利用基因步移法成功克隆出小鼠Doc-1R基因組序列。

功能篩選(function-driven screening)不依賴基因序列信息，篩選到的基因與數據庫中已知的基因往往具有較低的同源度，適用于大片段DNA文庫篩選。功能篩選的方法有兩種：一種是在選擇培養基上表型特征進行篩選。另一種方法是基于異源基因的宿主菌株與其突變體，在選擇性條件下依據功能互補生長的特性進行的[25]。此方法往往需要目的基因在宿主內能夠成功地表達并產生酶蛋白。但在篩選時細胞內潛脂類酶的活性能夠降低篩選的靈敏性，從而降低篩選的產率。已經證實使用細胞裂解劑能使酶分子從細胞內釋放出來并成功表達從而保持其本體構象[26]。

底物誘導基因表達法(SIGEX)是利用相關底物誘導基因編碼催化活性基因表達為基礎的篩選方法。該方法使用一種gfp操縱子捕獲載體，載體基因下游具有一個報告基因插入的克隆位點。插入基因表達時可以從報告基因衍生的信號被頻繁地識別出來，并在液體培養基中通過熒光激活細胞分離器(FACS)篩選陽性克隆。這種方法為高通量篩選提供了保障，但FACS對進樣設備的要求很高，同時其目的基因的結構性和適應性也十分敏感[27]。

2 宏基因組技術在新酶開發中的應用

利用宏觀基因組技術開發的新型酶蛋白大多具有新的序列，顯示了與已知的基因產品的非相似性，進而形成近親關系的深枝譜系。Jaeger等[28]利用大腸桿菌為宿主從8個蛋白質家族中篩選到41個編碼新型蛋白質的基因，包括二氫葉酸還原酶及轉運蛋白等。其中有些來自于同一家族的蛋白質具有不同的抗性序列，這些抗生素耐藥性蛋白序列揭示了不同變種所具有的蛋白功能。而這一系列新酶有效地推動了醫藥行業的發展。此外，多功能酶也作為重要的生物催化劑廣泛應用于食品、化學和生物燃料行業[5]。諸如此類的酶有從沿海海水宏基因組中尋找到的幾丁質酶[29]、土壤宏基因組中的乳酸解聚酶[30]、牛瘤胃內容物宏基因組中的β-葡萄糖苷酶等[31]。目前利用宏基因組技術開發酶的數量正在成指數級增長，這充分表明該技術對酶基因的篩選及修飾具有很高的使用價值[32]。

Ferrer等[33]在深海高鹽度環境中發現了5種酯酶，有2種與已知酯酶有顯著同源性。其結合了3個催化活性中心直接調節水解活性，是一種適應三級到四級結構之間的催化三聯體。同時建立了奶牛瘤胃宏基因文庫，利用噬菌體作為載體進行活性篩選。證實有22種克隆具有明顯的水解活性(12個酯酶、9個內切β-1,4葡聚糖酶及纖維糊精酶)，其中36%具有完全新的序列或與已知酯水解酶類及糖基水解酶類低同源性的深支親緣譜系[34]。這些酯酶能夠有效地水解丙酮縮甘油酸產生手性結構。并且其具有很強的催化水解脂肪、油及一系列羧基脂的能力，在食品工業被用在增加食品的風味、生產風味添加劑、去除污染物以及脂質廢物合成結構性甘油三酯，同時其能夠使白酒更純香、食醋更具風味[35]。

宏基因組在食品工業中開發的另外一組較有吸引力的酶是碳水化合物水解酶，如淀粉酶類、葡糖淀粉酶、纖維素酶和幾丁質酶等。Brennan等[36]從白蟻的腸道和鱗翅類動物的嘴中分離微生物的DNA建立基因文庫，從中篩選到了木聚糖酶，該酶能催化水解各種與β-1,4-相關的低聚木糖及高分子底物，并產生獨特的水解產物。在釀酒過程中其能夠提高酒精產率、澄清酒液，參與面包的制作及貯藏，在果汁制作中對果蔬細胞壁的去除及對產率的提高發揮著重要作用。磷酸吡哆醛作為VB6的主體藥物也被人們不斷加以重視。Tirawongsaroj等[37]從泰國溫泉宏基因文庫中利用功能篩選方法，找到了具有patatin基因的耐高溫脂肪水解酶磷酸吡哆醛。其在pH7～9，50～75℃范圍內展現了較大的活性，且在70℃時活性最高并可以保持穩定至少120min。

宏基因組技術作為新酶開發有利的工具，其開發的酶的數量正在穩定上升并且很快將超過利用傳統方法分離的酶。宏基因組技術分離的典型的酶還有β-葡萄糖苷酶、脂肪酶、多糖修飾酶(包括纖維素、α-淀粉酶、木聚糖酶、1,4-葡聚糖分支酶和果膠裂解酶)、蛋白酶、氧化還原酶、脫氫酶和參與維生素生物合成的酶等[38]。Duan等[39]從水牛瘤胃宏基因文庫中篩選到13個重組纖維素酶的克隆體。其中有2個克隆體具有降解多糖的基因，并且這些酶在較寬的pH值范圍內具有很好的活性。因此，在酒精生產過程中添加纖維素酶可以增加原料的利用率，提高酒精的質量。此外，β-葡萄糖苷酶能夠將水果、蔬菜及茶中的風味前體物質水解為濃郁的天然香氣物質；在釀酒及果汁加工過程中能增加風味物質，使杏仁、青梅果等食品脫苦。所以β-葡萄糖苷酶被廣泛應用于飲料加工行業。鄭艷等[40]利用畢赤酵母作為宿主菌通過序列篩選的方法使疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶得到了高效的表達。姜智賢等[41]利用這種酶進行酶促酯交換反應合成代可可脂。這種代可可脂具有與進口代可可脂相同的化學性質，口感與天然可可脂幾乎沒有差別，并且降低了反式脂肪酸的含量。多糖降解酶能夠降解多糖的糖苷鍵，使新形成的非還原端形成雙鍵。在食品加工過程中多糖降解酶被用于分析多糖結構，改善多糖物理學性質。這些酶在食品工業中為新產品的研發及生產提供了基礎，為食品行業的蓬勃發展提供了可能。

3 結 語

環境微生物總體是一個巨大的基因資源庫，人們利用現有技術僅僅能夠對其中一小部分進行探索，而宏基因組技術則可揭示環境中生物的多樣性及潛在生物催化劑。宏基因組技術跨越了傳統依靠微生物培養進行開發和探索的限制，直接從宏基因文庫中對DNA進行克隆和篩選，使不可培養微生物的開發成為了可能。現已利用宏基因組技術從文庫中開發出許多新型的酶制劑。這些酶制劑表現出了特有的催化性質，能夠被廣泛地應用于食品工業、醫藥業、環境治理等領域。雖然宏基基因組技術已經取得令人矚目的成績，但作為一種新興的技術手段，仍需科研工作者對其進行不懈地深入發展和廣泛應用，使其能夠更為有效地用于探索新的微生物資源。

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