無芒隱子草SAMS1基因的克隆及干旱脅迫下的表達分析

孔令芳，張吉宇，劉志鵬，王彥榮

（蘭州大學草地農業科技學院 草地農業生態系統國家重點實驗室 農業部草地農業生態系統學重點開放實驗室，甘肅 蘭州730020）

干旱、高鹽和低溫是限制植物生長和農作物產量的主要逆境因子，克服干旱、高鹽和低溫對農業生產的制約，培育具有良好抗逆特性的作物品種，一直是各國科學家關注的焦點［1］。近年來，隨著分子遺傳育種的發展，利用抗逆基因對作物進行基因工程改良已成為作物育種的重要途徑并且成效顯著［2］，而找到能夠直接利用的抗性基因是對作物進行基因工程改良的關鍵。

S－腺苷甲硫氨酸合成酶（S－adenosyl methionine synthetase，SAMS，EC 2.5.1.6）是植物代謝中的1個關鍵酶，它催化L－甲硫氨酸與ATP生物合成S－腺苷甲硫氨酸（SAM）。在生物學上，SAM是生物合成乙烯［3］以及多胺［4］的前體，參與了植物的轉甲基、轉氨丙基和轉硫反應等多種重要的生理過程［5］，SAM還可以與RNA結合參與基因表達調控［6］。SAMS基因與植物對干旱、鹽堿和低溫的抗性密切相關，并協助植物耐受多種非生物脅迫。岳昌武等［7］研究表明甘薯（Ipomoeabatatas）SAMS基因受低溫脅迫誘導表達；林凡云等［8］發現糜子（Panicum miliaceum）SAMS基因的表達涉及糜子響應干旱脅迫及干旱后復水過程，可能是糜子抗旱節水的關鍵基因；王士強［9］應用BSMV－VIGS技術對小麥（Triticumaestivum）的SAMS基因進行沉默導致沉默植株更易受干旱脅迫的影響，初步確定了S－腺苷甲硫氨酸合成酶基因和抗旱性的關系。化燁［10］利用耐鹽基因GsSAMS，構建了由誘導性啟動子rd29A和強組成型啟動子E12分別調控的GsSAMS基因的植物表達載體，培育出耐鹽堿轉基因苜蓿（Medicagosativa）新株系。截至目前，關于SAMS基因的研究多集中在玉米（Zeamays）、小麥等農作物中，很少涉及到草類植物。

無芒隱子草（Cleistogenessongorica）是禾本科多年生旱生草本植物，是荒漠草原和荒漠的建群種和優勢種［11，12］，飼用價值高，抗熱性、抗旱性和耐寒性強，具有作為優良的草坪草和生態草引種馴化的價值［12，13］，對促進畜牧業發展和維持脆弱生態系統具有重要作用［14，15］。近年來，對無芒隱子草種子萌發、出苗和幼苗生長對土壤水分的響應及無芒隱子草不同節間部位的種子休眠對高溫處理的響應等方面的研究較多［16，17］，而關于無芒隱子草中的SAMS基因尚未見報道。為了揭示無芒隱子草抗旱的分子基礎，本研究采用SMART技術構建了無芒隱子草在干旱脅迫下的cDNA文庫，以干旱誘導脅迫的cDNA文庫中獲得的SAMS1基因的EST序列為基礎，克隆其全長序列cDNA，并對其結構特點及其在干旱誘導過程中的表達模式等進行了初步分析，為進一步探討Cs－SAMS1基因的利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

1.1.1 材料與主要試劑 野生無芒隱子草種質于2004年采自內蒙古阿拉善地區。采集后保存在農業部牧草與草坪草種子質量監督檢驗測試中心（蘭州）低溫種子庫，2010年在蘭州大學草地農業科技學院盆栽試驗。

實驗所用的總 RNA分離試劑盒為 RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）、RNase free DNAse Set（Qiagen），cDNA合成試劑 盒 為 PrimeScriptTMRT－PCR Kit（TaKaRa）、pGEM－TEasy Vector Systems （Promega）、DNA Marker，DNA凝膠回收試劑盒，DH5α感受態細胞。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，其他試劑采用國產或進口分析純。

1.1.2 干旱脅迫處理 無芒隱子草幼苗移栽2周后，選取生長旺盛、大小一致的植株用于干旱脅迫處理，將塑料杯充分澆水后停止澆水進行自然干旱處理，干旱處理的時間從第1天到第10天植物出現嚴重缺水而萎蔫，第11天恢復澆水1次，第14天試驗結束。在此試驗期間，選取第0，4，6，8，10，11，14天，分別測定土壤含水量和葉片相對含水量，每處理10次重復；同時分別收集不同處理點單株的根、莖和葉樣品，液氮速凍后保存到－80℃冰箱，用于后續研究。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 采用RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）試劑盒提取無芒隱子草葉和根中的總RNA，用紫外分光光度計Nanodrop進行RNA純度測定，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA完整性。參照PrimeScriptTMRT－PCR Kit（TaKaRa）使用說明，取2μL無芒隱子草的總 RNA，以 Oligo dT為引物，進行cDNA第一條鏈的合成。

1.2.2 無芒隱子草SAMS1基因的全長cDNA克隆 根據獲得的無芒隱子草EST核心序列在NCBI上Blast，取相似性最高的全長序列，用DNAMAN 5.2.2設計引物，上游引物為P1，下游引物為P2，以從無芒隱子草擴增該基因的全長片段，預測片段長度為1 399bp。

用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目標片段，并與pGEM－TEasy載體連接，轉化感受態大腸桿菌DH5a，用藍白斑篩選結合Sp6和T7引物菌落PCR篩選陽性克隆。用Sp6和T7引物進行雙向測序（上海生工技術有限公司）。

1.2.3 半定量RT－PCR分析 利用DNAMAN 5.2.2設計CsSAMS1基因半定量RT－PCR分析引物，正向引物為P3，反向引物為P4，產物大小為450bp。以無芒隱子草GAPDH基因作為內參基因（正向引物為P5，反向引物為P6），產物大小為448bp。PCR反應體系為30μL，其中含3μL 10xDynazyme buffer，1.5μL dNTP，上下游引物各1.5μL，1μL DNA Polymerase Dynazyme，1μL First strand cDNA，20.5μL Deionized H2O。PCR循環為：94℃預變性1min，然后35個循環，每個循環94℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸1min，4℃保存。取5μL擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定后送上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.4 Realtime PCR 利用DNAMAN 5.2.2設計實時定量RT－PCR分析引物，正向引物為P7，反向引物為P8，產物大小為148bp。以無芒隱子草GAPDH基因作為內參基因（正向引物為P9，反向引物為P10），產物大小為150bp。相對定量采用2－△△CT方法，△△CT＝（CT目的基因－CT內參基因）實驗組－（CT目的基因－CT內參基因）對照，2－△△CT表示的是實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數，定量過程中設置3Biological replicants×2 Technical replicants，共6次重復［18］。

PCR反應體系為10μL，其中含5μL 2xSYBR mix，上下游引物各0.4μL，3.2μL滅菌水，1μL Template。反應程序采用兩步法：95℃酶激活10min，然后40個循環，每個循環95℃變性30s，60℃退火30s，結束。

表1 實驗所用的引物序列Table 1 Primer sequences was used

1.2.5 序列的生物信息學分析 通過 NCBI（http：//blast.ncbi.Nlm.nih.gov/Blast.cgi）網站進行Blast檢索，利用DNAMAN 6.0和Sequencher 4.9Demo生物技術軟件進行序列翻譯、多重比對以及同源樹等分析，采用NCBI的ORF finder預測開放閱讀框，NCBI的Blastp進行蛋白序列保守結構域分析。利用TMHMM 2.0 Serve（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）和 TMpred（http：//www.ch.embnet.org/Software/TMPRED）2個軟件同時對該蛋白序列的跨膜區域進行分析，利用 ProtScale（http：//www.expasy.ch/tools/protscale.html）網站進行該氨基酸序列的疏水性/親水性預測。利用 NPSA（http：//npsa－pbil.ibcp.fr/）中的MLRC程序在線分析蛋白質二級結構中α螺旋、無規則卷曲和延伸鏈等結構的預測。

2 結果與分析

2.1 SAMS1基因的全長cDNA擴增

以無芒隱子草該基因全長片段設計的上游引物P1，下游引物P2，經PCR擴增，產物由瓊脂糖凝膠電泳分離后呈現一條長約1 399bp的特異性條帶，與預期的片段大小一致（圖1），暫命名為CsSAMS1（Genbank登陸號FJ972821）。

圖1 PCR擴增產物電泳Fig.1 Ge1electrophoresis of PCR result

2.2 無芒隱子草SAMS1基因的表達模式分析

利用半定量和實時定量RT－PCR對CsSAMS1基因在干旱脅迫處理條件下的響應機構進行分析，分析所用的總RNA來自干旱脅迫8d后和未經脅迫處理的葉片和根系材料。半定量RT－PCR結果表明，干旱時CsSAMS1基因在葉中的表達量與未干旱對照基本一致而根中的表達量顯著增加（圖2）。

圖2 CsSAMS1在未干旱及干旱脅迫下的RT－PCR結果Fig.2 The RT－PCR results of CsSAMS1under non－drought and drought stress

實時熒光定量PCR的分析結果表明，干旱時Cs－SAMS1基因在葉中的表達量沒有增加，在根中的表達量明顯上升，為未干旱對照的2倍，與半定量RTPCR的分析結果相符，說明CsSAMS1基因的大量表達受干旱的誘導（圖3）。

2.3 CsSAMS1基因cDNA序列的生物信息學分析

ORF Finder程序在CsSAMS1cDNA序列的第68～1 258nt處發現有一連續ORF，第68～70nt處是該cDNA序列的第一個ATG密碼子，其下游的＋4位是G，上游－3位是A，符合典型的kozak規則［19］，結合推導的氨基酸序列N端同源性比較結果，可以認定第一個ATG是該基因的起始密碼子（圖4）。因此克隆得到的cDNA序列含有完整的ORF，編碼蛋白長397AA。

圖3 CsSAMS1在未干旱及干旱脅迫下的qRT－PCR結果Fig.3 The qRT－PCR results of CsSAMS1under non－drought and drought stress

疏水性分析結果表明（圖5），CsSAMS1多肽鏈具有最低的分值－2.056，親水性最強；最高的分值1.733，疏水性最強。整個多肽鏈表現為親水性，沒有明顯的疏水區域，對CsSAMS1基因進行跨膜域預測，沒有跨膜結構域，結果與疏水性分析相符合。將Cs－SAMS1基因氨基酸序列利用SOPMA軟件進行二級結構分析，可以看出該基因含有比較豐富的二級結構，以a－螺旋和無規卷曲為主，其中無規卷曲（cc）由164個氨基酸殘基組成，占41.41%；a－螺旋（Hh）由139個氨基酸殘基組成，占35.10%；連接條帶由59個氨基酸殘基組成，占14.59%；β－轉角由34個氨基酸殘基組成，占8.59%（圖6）。利用Pfam數據庫分析CsSAMS1基因的保守域，共含有3個保守域，N端從5到104個氨基酸殘基，C端從243到385個氨基酸殘基，中間是從119到241個氨基酸殘基。這個肽段包括甲硫氨酸結合域GHPDK；ATP結合域GAGDQG；一個九肽的以p－環形式存在的磷酸鹽結合區GGGAFSGKD；同時含有一個控制別越基因催化效率的活性中心PDIAQGVHGHFTKRPEEI（圖7）。

圖4 CsSAMS1的cDNA全長序列及推導的氨基酸序列Fig.4 The cDNA full length of CsSAMS1and its deduced amino acid sequence

圖5 CsSAMS1的疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity prediction result of CsSAMS1

2.4 不同植物SAMS基因的多重比較

小麥、大麥（Hordeumvulgare）、玉米、粳稻（Oryzasativajaponica）、秈稻（Oryzasativaindica）、石斛蘭 （Dendrobiumcrumenatum）、普 通 蓖 麻 （Ricinus communis）、胡頹子（Elaeagnusumbellate）、甘氨酸大豆（Glycinesoja）、毛果楊（Populustrichocarpa）、擬南芥 （Arabidopsisthaliana）、長 春 花 （Catharanthus roseus）、蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）、大洋洲濱藜（Atriplexnummularia）、無芒隱子草（Cleistogenes songorica）、紅薯（Ipomoeabatatas）及番木瓜（Carica papaya）17種植物的SAMS基因的氨基酸序列的系統進化樹分析顯示，不同組的基因被分到不同的分支，在進化上CsSAMS1與禾本科稻屬的SAMS親緣關系最近，與大麥屬和小麥屬的親緣關系次之，與蘭科石斛蘭屬的親緣關系較遠（圖8）。

從17種植物中挑選與CsSAMS1基因氨基酸序列相似度較高的5種植物的SAMS基因氨基酸序列進行多重比較，結果表明無芒隱子草中SAMS1基因的氨基酸序列與粳稻（秈稻）、大麥、小麥和玉米的SAMS基因的氨基酸序列相似度分別高達98.87%（98.62%），98.41%，98.07%，97.56%（圖9），說明該基因在植物進化中非常保守。

圖6 CsSAMS1基因的二級結構Fig.6 The secondary structure of CsSAMS1gene

圖7 CsSAMS1基因的保守區分析Fig.7 Conserved domains of CsSAMS1

3 討論

由SAMS所催化反應的產物S－腺苷甲硫氨酸（SAM）是生物合成乙烯前體［20］，而外源乙烯被證明可以誘導植物產生內源乙烯，因此乙烯利的處理可以誘導SAMS基因的大量表達。而SAM又是生物合成多胺的前體［21］，近年來的研究表明乙烯和多胺都參與了植物抗逆反應［22］，所以SAMS在植物抗逆生理方面發揮一定作用，大量研究發現SAMS基因受多種非生物脅迫誘導。

本研究對SAMS基因進行分析發現該基因全長為1 399bp，編碼397個氨基酸，含有典型的N端結構域，中間結構域和C端結構域。疏水性結果表明沒有明顯的疏水區域，沒有跨膜結構域，整個多肽鏈表現為親水性。易樂飛等［23］對條斑紫菜（Porphyrayezoensis）的SAMS基因進行疏水性分析結果表明，其親水性區域均勻分布在整個肽鏈中，PySAMS在一級結構上以親水性為主。PySAMS基因沒有跨膜結構域，結果與疏水性分析相符合。賈麗娜等［24］用ProtScale對玉米SAMS氨基酸序列的疏水性/親水性進行預測，結果表明整個多肽鏈表現為親水性，沒有明顯的疏水區域，SAMS基因沒有跨膜結構域，結果與疏水性分析相符合。

圖8 17種植物SAMS氨基酸序列的進化樹Fig.8 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of SAMSfrom seventeen plants

圖9 6種植物的SAMS氨基酸序列的多重比較Fig.9 Multiple alignment of SAMSfrom six plants

用neighbour－joining（NJ）法對無芒隱子草及有親緣關系的17種植物，構建系統發生進化樹（圖8），結果表明在進化上CsSAMS1與禾本科稻屬的SAMS親緣關系最近，與大麥屬和小麥屬的親緣關系次之，與蘭科石斛蘭屬的親緣關系較遠。將上述生物中與無芒隱子草親緣關系最近的5種植物的SAMS基因和CsSAMS1進行多重序列比對，對比結果顯示多種生物的SAMS基因高度相似，說明SAMS基因在其進化過程中非常保守。易樂飛等［24］將條斑紫菜的SAMS基因與其他4種植物的SAMS基因進行比對發現，PySAMS與綠藻門萊茵衣藻的SAMS親緣關系最近，與高等植物的親緣關系次之，與細菌的親緣關系最遠，進化樹反映出的親緣關系與傳統分類相符。

用半定量和實時定量RT－PCR的方法對CsSAMS1基因在干旱脅迫下的表達分析結果均表明，該基因在干旱脅迫時根中表達量顯著增加，為對照的2倍，而葉中的表達量在干旱脅迫前后無明顯變化。CsSAMS1基因在干旱脅迫第8天時表達量明顯增加，說明該基因主要參與無芒隱子草對干旱脅迫的響應過程。余濤等［25］在煙草（Nicotianatabacum）中克隆了一個SAMS基因，發現其表達受氧化脅迫、鹽脅迫及高溫脅迫的誘導。Ma等［26］發現鹽地堿蓬（Suaedaglauca）的SAMS基因受NaCl脅迫的正調控，酶活性檢測表明NaCl脅迫條件下該酶的活性增強。番茄（Lycopersiconesculentum）中SAMl和SAM3特異地受鹽、甘露醇和ABA的誘導表達［27］。Gupta等［28］證實白楊SAMS基因受高濃度CO2和O2脅迫的誘導。擬南芥、水稻中SAMS基因的表達在水分脅迫時表達量增加亦有報道［29］。小麥中的SAMS基因的表達受干旱和復水的誘導［30］。有研究證明玉米SAMS基因參與逆境脅迫響應，在玉米逆境應答中起作用［31］。

本研究從無芒隱子草中克隆得到了SAMS1基因的全長cDNA序列，具有SAMS基因的典型結構特征。通過與近緣植物SAMS的氨基酸序列多重比較發現，不同植物的SAMS的氨基酸相似程度非常高（92%～100%），說明SAMS基因在植物進化中非常保守。CsSAMS1基因在無芒隱子草幼苗干旱脅迫誘導時，在根中大量表達，葉中表達量變化不明顯，表明CsSAMS1基因可能是無芒隱子草抗旱性相關的基因。這為研究SAMS1基因在無芒隱子草中的表達分析、功能驗證、蛋白的分子結構及其結構與功能的關系等奠定了基礎，有助于闡明無芒隱子草SAMS1基因在逆境應答中的調控機制和功能，獲得的基因資源對抗旱草類作物的遺傳改良具有重要的指導意義。

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