玉簪屬植物花瓣中類黃酮化合物價值評價

劉妮娜，李曉東，張金政，王亮生，孫國峰，林秦文，徐彥軍

（1.中國科學院植物研究所，北京100093；2.中國科學院研究生院，北京100049；3.中國農業大學理學院，北京100094）

玉簪屬（Hosta）植物為百合科（Liliaceae）重要的耐蔭觀葉地被植物，世界各地廣泛栽培。該屬野生資源主要分布于東亞的溫帶與亞熱帶地區，包括中國的東部和南部、朝鮮、日本及俄羅斯的遠東地區，包括43種、35變種/變型。玉簪屬植物18世紀傳入歐洲，19世紀末傳入美國，經過長期的栽培及雜交育種已選育出栽培品種超過4 000個，其中注冊品種超過2 000個［1，2］。該屬植物除是重要的園林觀賞植物外，亦具有悠久的藥用歷史，“玉簪”之名始見于《本草綱目》［3］，其全草、根、莖及花均可入藥，具有清熱解毒、散結消腫之功效，主要治療乳癰、瘡癰潰瘍、毒蛇咬傷［4］；蒙古醫學以花入藥，治療咽喉腫痛、音啞、肺熱［5］。玉簪花的藥用價值很大程度上與其含有的類黃酮化合物有關，解紅霞等［5］對玉簪（Hostaplantaginea）花進行化學成分研究，95%乙醇滲濾液的乙酸乙酯萃取部分得到山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercertin）、山奈酚3－O－蕓香糖苷（kaempfeml－3－O－rutinoside）、山奈酚－7－O－β－D－葡萄糖苷（kaempferol－7－O－β－D－glucoside）；石油醚萃取物中經硅膠柱色譜依次用石油醚—乙酸乙酯梯度洗脫，得到化合物為正二十烷酸 （eicosanoic acid）和棕櫚酸－α－單甘油酯 （hexadecanoic acid 2，3－dihydroxypropyl ester）［5，6］。2003年，鐘國躍等［7］研究發現紫萼玉簪（H.ventricosa）對早期、中期炎癥均有較強的抑制作用。類黃酮化合物是廣泛存在于自然界的一大類化合物，常以游離態或糖苷形式存在，具有多方面生物活性，包括：抗癌、抗腫瘤、抗心血管疾病、抗炎鎮痛、免疫調節、降血糖、治療骨質疏松、抑菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老以及抗輻射等［8－13］。

玉簪屬植物種質資源非常豐富，遍布世界各地，從目前查閱到的國內外研究文獻來看，人們更加重視玉簪屬植物根葉部位的成分研究，而對玉簪屬植物花的藥用價值研究還很有限，缺少進一步應用該屬植物花朵的理論依據。因此應該加大對該屬植物花朵部位化學成分研究及活性成分篩選的力度，以發現該屬植物的新用途，以更好的造福人類。本研究擬對玉簪屬5個野生種和85個栽培品種花瓣中類黃酮成分進行系統的分離鑒定，為進一步豐富玉簪屬植物資源的利用提供科學依據［14，15］。

1 材料與方法

1.1 植物材料及試劑

試驗材料為玉簪屬5個野生種和85個栽培品種（表1）的盛花期花瓣，均于2010年6－10月，采自中國科

學院植物研究所植物園玉簪種質資源圃（39°48′N，116°28′E，海拔76m）。所有試驗材料均采用相同的栽培措施（包括相同的施肥、灌溉及病害防治等）?；ò瓴杉笾糜冢?0℃冰箱保存，用于后續分析。

表1 玉簪野生種、品種表Table 1 Hostaspecies and cultivars

試劑：乙腈和甲醇（色譜純）購于北京先明樂施科技發展有限公司。三氟乙酸（≥99%）購于德國Merck公司（Darmstadt，Germany）。甲醇（分析純）和甲酸（分析純）購自北京化工廠。HPLC級水由 Milli－Q超純水系統（Millipore，Billerica，MA，USA）制備。黃酮醇標準品：蘆丁（純度91.7%）、山奈酚3，7－二葡萄糖苷購自中國藥品生物制品檢定所，用于黃酮醇定性定量分析。

1.2 類黃酮化合物提取

每個處理稱取2g花瓣材料，加液氮研磨成粉末，溶于5mL甲醇－甲酸（98∶2，V/V）的抽提溶劑，黑暗條件下4℃浸提24h，期間每隔6h于旋轉振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，江蘇）振蕩混勻1次。之后超聲振蕩30min，離心（12 000r/min，10min），收集上清液。濾渣分次加入3mL，2mL抽提液，進行第2、3次的抽提，合并收集的上清液。0.22μm尼龍微孔濾膜過濾后保存在－20℃冰箱，用于HPLC－DAD或HPLC－MSn分析。每個處理重復3次。

1.3 類黃酮化合物定性、定量分析

采用 Agilent 1100LC/MSD Trap VL 液質聯用儀（HPLC－ESI－MSn）進行類黃酮定性分析。色譜條件為：采用TSK gel ODS－80Ts QA（150mm×4.6mm，5μm i.d.，Tosoh，Tokyo，Japan）色譜柱；檢測波長350nm；流動相組成：A相0.1% 甲酸－水溶液；B相0.1%甲酸－乙腈溶液，洗脫程序：0min，5%B；10min，10%B；12min，11.7%B；15min，12%B；35min，13.4%B；40min，20%B；55min，29%B；60min，5%B；流速0.8mL/min；溫度35℃，進樣量10μL。質譜電離源采用電噴霧電離（ESI），分別在正離子和負離子模式下進行全掃描，掃描范圍：（m/z）100～1 000u。正離子模式下質譜分析條件為：氮氣作為干燥和噴霧氣體，干燥溫度350℃，氮氣流速6.0 L/min，噴霧器壓力：241.3kPa；毛細管電壓：3 500kV，毛細管出口電壓：140V；八級射頻電壓振幅：150Vpp；skim 1電壓：55.6V，skim 2電壓：6.0V；cap exit offset，84.4V。負離子模式下，參數設定值不同的為：毛細管出口電壓：－127.3V；skim 1電壓：－47.7V，skim 2電壓：－6.0V；cap exit offset，－79.6V。用 LC/MSD Trap軟件（5.2版本）分析不同模式下的質譜數據。依據樣品HPLC分析的保留時間、洗脫順序、紫外－可見吸收光譜和質譜信息，通過與標準品以及參考文獻［12－14］比較得出類黃酮化合物的結構。

采用Dionex HPLC系統進行類黃酮化合物定量分析。該系統包括P680泵、TCC－100自動控溫柱箱、PDA－100光電二極管陣列檢測器。色譜條件與類黃酮化合物定性分析一致。利用標準品蘆丁分別對黃酮/黃酮醇總量（TF）進行半定量分析，重復3次，單位為每克新鮮花瓣中含有的毫克數。

1.4 統計分析

用SPSS 16.0對數據進行聚類分析、主成分分析，并用SigmaPlot 10.0對數據作盒須圖。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

以蘆丁標準溶液繪制了標準曲線，并測定了方法的靈敏度。結果表明，在所檢測的濃度范圍內，響應值與濃度高度線性相關，相關系數r2＞0.999 3。LOD為0.229μg/mL；LOQ為0.764μg/mL（表2）。

表2 分析方法的線性檢驗（y＝kx＋m）及檢測限、定量限Table 2 Linearity of response for rutin using the separate method（Calibration fitting：y＝kx＋m）and LOD，LOQ

2.2 玉簪屬植物類黃酮化合物定性分析

表3列出了玉簪花中檢測到的類黃酮化合物的紫外可見吸收光譜和質譜數據［16－20］。其中，負離子模式下的質譜數據為化合物的結構解析提供了更多信息［20］。共發現3種黃酮醇苷元和1種黃酮苷元，分別為：kaempferol（1，2，4，5，6，7，8，9，13，14，15，16和17）、quercetin（11，12）、isorhamnetin（3）和luteolin（10）（表3、圖1）。

表3 玉簪類黃酮組分的紫外—可見吸收光譜與質譜數據Table 3 HPLC－DAD and HPLC－ESI－MSn analysis as well as the structure characterization and tentative identification of glycosides of flavone，flavonol in petals of Hosta

圖1 灰黑葉玉簪（左）和披針葉玉簪（右）黃酮類組成的HPLC圖譜（檢測波長：350nm）Fig.1 DAD－chromatogram of flavonoids recorded at 350nm of H.nigrescens（left）and H.lancifolia（right）

HPLC－ESI－MSn分析結果表明，組分1通過與標準品的共洗脫和紫外吸收光譜的比較鑒定為山奈酚3，7－二葡萄糖苷（kaempferol 3，7－di－O－glucoside，Km3G7G）。組分2，3，8，9（圖1）的質譜裂解行為與kaempferol 3，7－di－O－glucoside相似，表明它們是黃酮醇3，7－二糖苷。此類化合物在負離子模式下的碎片離子可以提供糖苷化位置的可靠信息［20］。在黃酮醇糖苷的MS2質譜中，準分子離子［M－H］－失去3－位的糖基產生的離子記為Y03－，而失去7－位糖基的記為Y07－。由于［M－H］－更容易失去7－位上的糖基，Y07－的相對豐度通常比Y03－高［21］。根據以上原理，將組分2，3，9分別推定為山奈酚 3－葡萄糖－7－蕓香糖苷（kaempferol 3－O－glucosyl－7－O－rutinose），異鼠李素3，4－二葡萄糖苷（isorhamnetin 3，4－di－O－glucoside）［19］和山奈酚3－葡萄糖－7－鼠李糖苷（kaempferol 3－O－glucosyl－7－O－rhamnoside）。組分8的MS2質譜信息與1相同，且8的洗脫順序在后，推測可能是半乳糖參與了糖苷化，由于沒有更多的證據，暫將8推定為山奈酚3，7－二己糖苷（kaempferol 3，7－di－O－hexoside）。

組分4，5和6的［M－H］－離子在MS2分析中都有丟失碎片m/z174u，m/z206u，m/z158u的現象，推測這3個化合物為黃酮醇的酰化葡萄糖苷。將組分4，5和6的紫外吸收光譜與標準品Km3G7G進行比較，推定4為山奈酚3－奎尼酰葡萄糖苷（kaempferol 3－O－quinoylglucoside）、5為山奈酚 3－芥子酰葡萄糖苷（kaempferol 3－O－sinapoylglucoside）、6為山奈酚3－抗壞血酰葡萄糖苷（kaempferol 3－O－ascorbicoylglucoside）。

10號峰的質譜數據顯示是木犀草素的衍生物，MS2質譜中只能觀察到m/z447（［M－H－146u］－），而沒有m/z431（［M－H－162u］－），表明木犀草素是被一種雙糖糖苷化的。根據碎片m/z449（［M＋H－146u］＋）的相對豐度大于m/z287（［Y0＋，M＋H－（146＋162）u］），判斷雙糖之間的糖苷鍵是1→2連接方式［20］。再比較10號峰的紫外吸收光譜，最終將10號峰推定為木犀草素7－新橙皮糖苷（luteolin 7－O－neohesperidoside）。同樣，將7號峰推定為山奈酚7－新橙皮糖苷（kaempferol 7－O－neohesperidoside），13號峰被推定為山奈酚3－刺槐二糖甙（kaempferol 3－O－robinobioside）［22］。

組分11，正離子模式下檢測到高豐度的苷元離子m/z303（Y0＋），負離子模式下檢測到相應的離子m/z301（Y0－）。再結合它們在色譜柱中的洗脫順序和紫外可見吸收光譜數據，組分11被推定為槲皮素衍生物。組分11在（＋）ESI－MS下的分子離子m/z465（［M＋H］＋）和（－）ESI－MS下的去質子分子離子m/z463（［M－H］－）表明糖基為一個己糖分子。而負離子模式下相對高豐度的自由基苷元離子m/z300（［Y0－H］－）說明糖基化位置在3位上。組分11最終確定為槲皮素3－葡萄糖苷 （quercetin 3－O－glucoside）［23］。根據紫外可見吸收光譜，洗脫順序，負離子模式下的分子離子m/z477（［M－H］－），正離子模式下的分子離子m/z501（［M＋Na］＋），組分12被推定為槲皮素3－葡萄糖酸苷（quercetin 3－O－glucuronide）［24］。

組分13鑒于紫外最大吸收波長265nm（Band II）［22］，正離子模式下的苷元碎片離子m/z287（Y0＋）以及負離子模式下的苷元離子m/z285（Y0－）和自由基苷元離子m/z284（［Y0－H］］－）。組分14和15在正離子模式下檢測到顯著的加鈉分子離子m/z471（［M＋Na］＋），負離子模式下檢測到去質子分子離子m/z447（［MH］－），分子量正好是在山奈酚分子量的基礎上加上一個己糖的分子量162u，由此確定組分14的結構為山奈酚3－葡萄糖苷（kaempferol 3－O－glucoside），組分15為山奈酚3－葡糖苷酸（kaempferol 3－O－glucuronide）。

16號峰正離子模式下檢測到顯著的加鈉分子離子m/z441（［M＋Na］＋）和苷元離子m/z287（Y0＋），負離子模式下也檢測到相應的分子離子m/z417（［M－H］－）和自由基苷元離子m/z284（［Y0－H］－），這些都是戊糖苷化的山奈酚或木犀草素的特征質譜數據。同時該化合物在265nm，而不是255nm有最大吸收，即是山奈酚的紫外特征吸收。但尚無法確實戊糖是木糖還是阿拉伯糖，因此組分16暫定為山奈酚3－戊糖苷（kaempferol 3－O－pentose）。

在負離子模式下，當苷元的3－位發生糖苷化時，［Y0－H］－的相對豐度大于Y0－；而7－位發生糖苷化時則相反，Y0－的相對豐度更高［20］。并且2種糖苷的紫外特征吸收波長不同，類黃酮7－糖苷的特征吸收帶I與3－糖苷相比發生紅移［25］。根據 MS和 UV光譜數據（表3），推定17號峰為山奈酚7－葡萄糖苷（kaempferol 7－O－glucoside）。

2.3 玉簪屬植物類黃酮化合物定量分析

為了進一步篩選應用價值大的玉簪種質，首先依據類黃酮化合物成分對選定的玉簪種質進行聚類分析（圖2）。當選取5為聚類距離時，玉簪分為2類。通過比較2類玉簪種質的類黃酮組成，發現I類中kaempferol 3，7－di－O－hexoside、kaempferol 3－O－glucuronide含量相對較高，II類中kaempferol 3－O－glucosyl－7－O－rutinose含量最高。進一步依據玉簪類黃酮化合物含量進行主成分分析，發現聚類分析中I類主要分布在組分8，15得分值高的區域；II類主要分布在組分2得分值高的區域（圖3）。分別對I、II類作盒須圖（圖4），可以更加清晰明了的看出2類的區別。在以kaempferol 3，7－di－O－hexoside、kaempferol 3－O－glucuronide為主成分的I類中，山地玉簪（H.montana）為kaempferol 3，7－di－O－hexoside含量最高的品種，達到1.41mg/g。玉簪‘蒙特利爾’（Hosta‘Montrealensis’）為kaempferol 3－O－glucuronide含量最高的品種，達到1.08mg/g。在II類當中，野生種披針葉玉簪（H.lancifolia）為kaempferol 3－O－glucosyl－7－O－rutinose含量最高的玉簪種質，達到2.11mg/g，同時披針葉玉簪還是類黃酮總量最高的玉簪種質，達到2.94mg/g（表4）。

圖2 玉簪聚類樹形圖Fig.2 Hierarchical diagram showing the classification results using cluster analysis of the flavonoids profile

圖3 主成分因子得分圖Fig.3 PCA scatter diagram of samples based on flavonoids profile

圖4 不同玉簪品種中類黃酮組成Fig.4 Flavonoids constitutions from different species and cultivars of Hosta

表4 玉簪花的類黃酮組成及定量分析Table 4 Flavonoid constitutions and relative quantity of flavonoid in Hosta mg/g

續表4 Continued

續表4 Continued

3 結論

目前，從植物中尋找具有各種生物活性的天然化合物備受人們關注。玉簪屬植物不僅是重要的耐蔭觀葉地被植物，由于其多個部位均可入藥，在民間及蒙藥中廣泛應用于乳癰、咽喉腫痛、肺熱等多種炎癥的治療。玉簪屬植物類黃酮化合物組成有其特殊性，但相關研究卻一直沒有引起人們的足夠重視。到目前為止，僅見解紅霞等［5］對玉簪花的類黃酮成分的初步研究，得到山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercertin）、山奈酚3－O－蕓香糖苷（kaempfeml－3－O－rutinoside）和山奈酚－7－O－β－D－葡萄糖苷（kaempferol－7－O－β－D－glucoside）。為豐富玉簪屬植物的開發利用，有必要利用高效液相色譜（HPLC－DAD）技術，建立了定量分析玉簪花中類黃酮化合物的HPLC方法，可作為玉簪花藥材的質量控制方法。同時結合質譜（MSn）技術，鑒定了玉簪花瓣中類黃酮化合物的化學結構，并篩選出其富含類黃酮化合物的種質資源。

本研究以玉簪屬5個野生種和85個栽培品種的花瓣為材料，利用高效液相色譜（HPLC－DAD）結合質譜（MSn）技術，鑒定了玉簪花瓣中17種類黃酮化合物的化學結構，分別為：山奈酚3，7－二葡萄糖苷、山奈酚3－葡萄糖－7－蕓香糖苷、異鼠李素3，4－二葡萄糖苷、山奈酚3－奎尼酰葡萄糖苷、山奈酚3－芥子酰葡萄糖苷、山奈酚3－抗壞血酰葡萄糖苷、山奈酚7－新橙皮糖苷、山奈酚3，7－二己糖苷、山奈酚3－葡萄糖－7－鼠李糖苷、木犀草素7－新橙皮糖苷、槲皮素3－葡萄糖苷、槲皮素3－葡糖苷酸、槲皮素3－刺槐二糖苷、山奈酚3－葡萄糖苷、山奈酚3－葡糖苷酸、山奈酚3－戊糖苷和山奈酚7－葡萄糖苷。并比較了90種玉簪花中類黃酮化合物成分與含量的差異性，篩選出類黃酮化合物含量較高的種類：山地玉簪（H.montana）為kaempferol 3，7－di－O－hexoside含量最高的品種；玉簪‘蒙特利爾’（Hosta‘Montrealensis’）為kaempferol 3－O－glucuronide含量最高的品種；野生種披針葉玉簪（H.lancifolia）為kaempferol 3－O－glucosyl－7－O－rutinose含量最高的玉簪種質，同時也是類黃酮總量最高的玉簪種質。

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