水淹對(duì)雙穗雀稗抗氧化酶活性及碳水化合物含量的影響

譚淑端，朱明勇，張克榮，朱佳文，魏杲霞，張全發(fā)＊

（1.中國科學(xué)院武漢植物園水生植物與流域生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢430074；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410128）

因?yàn)樗蜅l件下，植物體內(nèi)氧氣和二氧化碳等氣體擴(kuò)散和植物對(duì)光照的獲取受到限制，使水淹成為植物遭受的主要的非生物脅迫之一。在缺氧植物細(xì)胞中，其氧化脅迫反應(yīng)與分子氧還原成超氧陰離子自由基，單線態(tài)氧，羥氫氧基和過氧化氫等有毒的自由基［1］。為了抵抗活性氧分子的毒害作用，植物進(jìn)化了一套包括抗氧化酶及其代謝物等組成的復(fù)雜的抗氧化酶防御系統(tǒng)，為植株抵御厭氧或缺氧脅迫并生存下來起著至關(guān)重要的作用［2－4］。

許多研究已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量水平和其在植物耐淹能力和露出水面后的恢復(fù)生長能力方面的重要性［5，6］。與對(duì)水淹生境敏感的物種相比，耐淹物種通常會(huì)抑制葉片和莖的伸長生長，從而保持高的碳水化合物儲(chǔ)量，當(dāng)脅迫生境解除時(shí)，能夠恢復(fù)生長而幸存下來［5］。物種在解除水淹脅迫時(shí)，能保存6%的淹水前體內(nèi)碳水化合物的含量，當(dāng)其回到正常生長環(huán)境條件下，能快速的長出新的葉片［5］。因此，植株水淹后能保持高生物儲(chǔ)量，有利于其對(duì)水淹脅迫的忍耐和抵抗。

根據(jù)三峽大壩運(yùn)行的實(shí)際規(guī)律，9月下旬水庫開始蓄水，水位逐步升高至175m；12月至次年4月，維持在較高水位；5月開始才逐步降低水位，將原陸地生境變?yōu)槎年懡惶嫘蜕场Ｒ虼耍笥糜谠撎幹脖换謴?fù)的物種具備水淹季節(jié)主要是冬季耐淹，露出水面后能快速恢復(fù)生長。

雙穗雀稗（Paspalumdistichum）是一種多年生禾本科單子葉雜草，夏綠冬枯，為典型的暖季型草。它的根系和根狀莖相當(dāng)發(fā)達(dá)。譚淑端等［7］的研究表明雙穗雀稗經(jīng)過25m深連續(xù)5個(gè)月的水淹脅迫后，其生存率仍在80%以上，是一種潛在的適于三峽水庫消落帶植被恢復(fù)的物種。本試驗(yàn)試圖研究雙穗雀稗經(jīng)受不同深度和不同水淹持續(xù)時(shí)間的脅迫后植株體內(nèi)抗氧化酶活性及可溶性糖和淀粉含量的變化，探討雙穗雀稗對(duì)水淹脅迫的形態(tài)生理方面的響應(yīng)，為進(jìn)一步探究雙穗雀稗用于三峽庫區(qū)消落帶或其他河岸帶植被恢復(fù)的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

研究地點(diǎn)為湖北宜昌秭歸蘭陵溪，地處長江上游下段的三峽河谷地帶，屬鄂西南山區(qū)（E 110°54′，N 30°52′）。該地屬亞熱帶季風(fēng)氣候，≥10℃的年活動(dòng)積溫為5 723.6℃，年最冷月平均溫度為6.5℃，年無霜期為306d，降水量為1 000mm左右，空氣相對(duì)濕度72%，年日照時(shí)數(shù)1 631.5h。

于2008年8月底選取三峽庫區(qū)自然消落帶生長的雙穗雀稗當(dāng)年生分蘗苗作為研究對(duì)象（中國科學(xué)院武漢植物園秭歸三峽消落帶研究試驗(yàn)基地提供）。將生長均勻的分蘗苗移入塑料桶中，每桶5株。桶內(nèi)徑為30cm，桶高15cm，桶底鉆孔。土壤基質(zhì)采用三峽庫區(qū)蘭陵溪岸邊的砂壤土。移栽的植株間隔30cm均勻的放置在蘭陵溪開闊的自然環(huán)境下盡量使其保持生長一致。

1.2 方法

于2008年11月2日將所有盆栽植株置于三峽水庫支流蘭陵溪進(jìn)行水淹處理，未淹對(duì)照于當(dāng)?shù)刈匀粭l件下生長。水淹設(shè)4個(gè)不同處理（0，1，5和15m），分別在水淹的0，3，7，15，30，60，90，120和150d取樣，每個(gè)處理重復(fù)3次，立即用自來水沖洗干凈。取適量的新鮮根用液氮冷凍，然后放到－70℃儲(chǔ)藏用于丙二醛（MDA），過氧化氫酶（catalase，CAT），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），過氧化物酶（peroxidase，POD），谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）等指標(biāo)的測定。另一部分根和莖用冰盒帶到實(shí)驗(yàn)室，用于可溶性糖和淀粉含量的測定。

試驗(yàn)的水淹時(shí)間主要是根據(jù)三峽水庫運(yùn)行節(jié)律來定的（11月－4月水淹）。

1.3 指標(biāo)測定

丙二醛含量測定按照張志良和瞿偉菁［8］的方法。過氧化氫酶活性（CAT）測定參照Aebi和Bergmeyer［9］的方法。超氧化物歧化酶活性（SOD）和過氧化物酶活性（POD）測定參照李合生［10］的方法。谷胱甘肽還原酶（GR）測定參照Foyer和 Halliwell的方法［11］。抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定參照Nakano和Asada的方法［12］。可溶性糖和淀粉含量的測定主要是參照文獻(xiàn)［13］的方法。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)通過SPSS 13.0進(jìn)行方差分析及差異顯著性檢驗(yàn)，并用LSD多重比較進(jìn)行所需的后續(xù)檢驗(yàn)（P＝0.05或P＝0.01）。用Levene法檢驗(yàn)方差齊性，方差不齊對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og10的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果與分析

2.1 MDA含量變化

水淹植株體內(nèi)MDA含量比未淹對(duì)照植株MDA含量高 （圖1）。1，5和15m深水淹處理植株體內(nèi)MDA含量隨水淹脅迫時(shí)間的增加而增大。即水淹深度越大，水淹脅迫時(shí)間越長的處理，植株體內(nèi)MDA含量越高。1和5m深水淹處理，在水淹時(shí)間的0～90d內(nèi)，植株體內(nèi)MDA含量增加緩慢，而且相同水淹時(shí)間處理植株體內(nèi)MDA含量差異不顯著（P＞0.05）。從水淹的90d，1和5m深水淹植株體內(nèi)的MDA含量隨著水淹時(shí)間的延長呈急劇的增加。15m深水淹處理植株，從試驗(yàn)開始到連續(xù)水淹的60d，植株體內(nèi)MDA含量隨水淹時(shí)間的延長呈遞增趨勢。從水淹的60d到水淹的90d，植株體內(nèi)MDA含量驟降，然后又隨著水淹深度的增加而增加。

圖1 不同水淹脅迫對(duì)植株根系MDA含量變化的影響Fig.1 Effects of different submergence stress on MDA content of roots

2.2 抗氧化酶活性

水淹脅迫處理植株CAT含量隨水淹時(shí)間延長的變化趨勢與未淹處理植株隨試驗(yàn)時(shí)間延長的變化趨勢基本一致（圖2），都是隨水淹脅迫處理時(shí)間的延長，植株體內(nèi)CAT含量呈增加趨勢。3個(gè)深度水淹處理植株CAT含量的最大值出現(xiàn)在水淹脅迫處理后的第120天。隨后，植株的CAT含量都隨著處理時(shí)間的增加變化較平緩，直到試驗(yàn)結(jié)束。盡管所有水淹處理植株的CAT比對(duì)照植株的高，但CAT含量的多少與植株遭受的水淹脅迫程度的高低比較一致。即隨脅迫程度的增加其值也相應(yīng)較大。植株分別經(jīng)受1，5和15 m深連續(xù)150d的脅迫處理后，CAT分別為7.86，9.27和10.22U/g FW，分別是脅迫處理開始時(shí)植株體內(nèi)CAT含量的14.83，17.48和19.28倍。

未淹對(duì)照處理植株SOD活性隨試驗(yàn)時(shí)間的變化不顯著（P＞0.05）。從水淹開始到水淹的第60天，1，5和15m深度處理植株體內(nèi)SOD活性都隨著水淹脅迫處理時(shí)間的遞增呈增加趨勢。隨后，3個(gè)深度脅迫處理植株體內(nèi)SOD活性隨水淹脅迫時(shí)間的遞增而下降，直到試驗(yàn)結(jié)束。但整個(gè)試驗(yàn)期間，試驗(yàn)時(shí)間相同，水淹深度脅迫處理不同的植株體內(nèi)，被淹植株SOD含量都較未淹對(duì)照植株大。總體上來說，SOD的含量大小與其遭受的脅迫程度有關(guān)（水淹持續(xù)時(shí)間和水淹深度）。不同水淹脅迫處理植株SOD含量存在顯著差異（P＜0.05）。

本試驗(yàn)中未淹對(duì)照植株與被淹植株一樣，植株體內(nèi)POD活性一致地隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長而遞增。在水淹的15d內(nèi)，未淹對(duì)照植株P(guān)OD活性與1，5和15 m水淹處理植株存在顯著差異（P＜0.05）。1和5m深水淹處理植株之間差異不顯著（P＞0.05），但他們與15m深處理植株之間差異顯著（P＜0.05）。從水淹試驗(yàn)的第15天開始，所有試驗(yàn)處理植株體內(nèi)POD活性較前期增加幅度加大。不同深度水淹處理植株之間，POD活性隨水淹脅迫的增加程度與其遭受的脅迫程度呈正相關(guān)。

圖2 不同水淹脅迫對(duì)植株根系POD，CAT，SOD活性變化的影響Fig.2 Effects of different submergence stress on POD，CAT，SOD activities of roots

未淹對(duì)照植株體內(nèi)APX和GR活性隨試驗(yàn)時(shí)間的變化不顯著（P＞0.05）（圖3）。水淹脅迫誘導(dǎo)了植株體內(nèi)APX和GR活性的增加。除了1m深水淹處理植株體內(nèi)GR活性隨試驗(yàn)處理時(shí)間的延長增加幅度較少外，其他受淹處理植株體內(nèi)的APX和GR活性隨水淹脅迫時(shí)間的延長增加幅度較大。5和15m深水淹脅迫處理植株APX活性的最大值分別出現(xiàn)在持續(xù)水淹的30和60d。1，5和15m深水淹脅迫處理植株體內(nèi)GR活性最大值分別出現(xiàn)在持續(xù)水淹后的90，90和60d。APX和GR活性的增加幅度基本上都隨著水淹脅迫程度的增加而增加。

2.3 碳水化合物消耗

在試驗(yàn)的7d內(nèi)，未淹對(duì)照植株莖可溶性糖含量隨試驗(yàn)時(shí)間的延長呈增加趨勢（圖4）；從試驗(yàn)的第7天開始，莖的可溶性糖含量隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長呈遞減趨勢；試驗(yàn)進(jìn)行到120d，其減少的程度增大。分別經(jīng)受1，5和15 m深水淹植株，其莖可溶性糖含量一致的隨水淹時(shí)間的遞增而減少，且水淹深度越大其減少程度越大。從開始水淹到水淹脅迫的第60天，1和5m深受淹植株可溶性糖的下降幅度較大；從水淹的第60天開始，被淹植株體內(nèi)可溶性糖含量的下降比較平緩，直到水淹脅迫的120d，隨之，其下降幅度加劇。15m深被淹植株在水淹的15 d內(nèi)，體內(nèi)可溶性糖含量的下降較大，隨之下降平緩直到水淹的90d。從水淹的90d直到試驗(yàn)結(jié)束（水淹150d），15m深植株體內(nèi)可溶性糖含量的下降隨水淹深度的遞增而加劇。

圖3 不同水淹脅迫對(duì)植株根系A(chǔ)PX，GR活性變化的影響Fig.3 Effects of different submergence stress on APX and GR activities of roots

圖4 不同水淹脅迫對(duì)植株莖和根的可溶性碳水化合物和淀粉含量變化的影響Fig.4 Effects of different submergence stress on the total soluble sugar and starch contents of shoot and root

受不同水淹深度脅迫植株根可溶性糖含量隨水淹脅迫時(shí)間的變化情況與未淹植株的變化有差異（P＜0.05）。從水淹開始到第7天，未淹對(duì)照植株根可溶性糖含量隨試驗(yàn)時(shí)間的延長有所增加；從試驗(yàn)的第7天開始，試驗(yàn)植株根可溶性糖含量隨著試驗(yàn)的延續(xù)呈逐漸下降的趨勢。從試驗(yàn)開始到水淹的30d，1，5和15m水淹植株根可溶性糖含量一致地隨著水淹時(shí)間的遞增呈劇烈的減少，然后其下降趨于平緩，直到試驗(yàn)結(jié)束。植株遭受的水淹脅迫程度越大，其根可溶性糖含量的下降幅度也越大。

除未淹對(duì)照植株從開始試驗(yàn)到第5天，其莖淀粉含量略有增加外，其他處理植株，根莖淀粉含量一致的隨試驗(yàn)時(shí)間的增加而減少（圖4）。整個(gè)試驗(yàn)期間，未淹對(duì)照植株莖淀粉含量的減少比較平緩。1，5和15m水深處理植株，在受淹的前3d，莖淀粉含量下降顯著，隨之處于下降的平緩期，直到水淹的第15天，然后，各受淹處理植株莖淀粉含量呈急劇的下降。總體上，所有處理植株根淀粉的減少程度較莖淀粉的減少程度大。未淹對(duì)照植株從試驗(yàn)的第15天到30天，根淀粉含量有一個(gè)劇烈的下降外，其余試驗(yàn)時(shí)間，根淀粉含量的減少處于相對(duì)平緩。但總趨勢是隨著試驗(yàn)時(shí)間的遞增其含量呈遞減趨勢。

3 討論

氧氣在水中的溶解性是很低的。氧濃度從大氣中的約266×10－6g/cm3（8.31mol/m3）到水中的少于8.26×10－6g/cm3（0.25mol/m3）［14］。當(dāng)氧氣濃度≤5%時(shí)，植物會(huì)遭受厭氧或缺氧脅迫［15］。因此，植株部分或全部水淹會(huì)限制植株體內(nèi)氧的擴(kuò)散，從而限制植株的有氧呼吸。水稻（Oryzasativa）和蘆葦（Phragmitescommunis）等耐淹植物進(jìn)化了許多在厭氧或缺氧環(huán)境中生存下來的機(jī)制。這些機(jī)制包括：1）在氧氣缺乏的條件下，植株體內(nèi)抗氧化酶活性的作用來平衡植株體內(nèi)活性氧分子的毒害作用［16］；2）受淹植株通過改變能量代謝來保持活力所需的能量，直到水淹環(huán)境得到改善［17］。那么這些適應(yīng)策略是否是促成雙穗雀稗耐長期水淹脅迫的策略呢？本試驗(yàn)針對(duì)這個(gè)問題進(jìn)行了探討。

3.1 抗氧化酶活性的變化

厭氧組織中自由脂肪酸增加，細(xì)胞膜滲漏，細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)喪失。在正常膜功能和膜功能瓦解之間，只有很少的一段距離。從丙二醛（MDA）和乙烷等物質(zhì)的出現(xiàn)可以很充分的證明細(xì)胞發(fā)生了脂質(zhì)過氧化［18］。本試驗(yàn)中，測定了各處理植株體內(nèi)MDA含量的變化。MDA值基本上是隨著水淹脅迫時(shí)間的延長和脅迫程度的增大而增大的，說明了被淹植株遭到了不同程度的傷害。耐厭氧脅迫植物對(duì)厭氧脅迫的主要策略之一可能是確保植株在厭氧條件下膜脂的穩(wěn)定性，及保護(hù)厭氧脅迫植株各組織免遭過氧化傷害，而抗氧化酶系統(tǒng)在其中發(fā)揮著重要的作用。

濕地生境生長的具有地下莖的物種通常生來就具有很好的防御厭氧脅迫傷害的能力。比較研究了耐缺氧物種黃菖蒲（Irispseudacorus）和不耐缺氧物種德國鳶尾 （Irisgermanica）的越冬塊莖內(nèi)過氧化酶對(duì)植株抵抗缺氧脅迫后過氧化傷害的作用。在經(jīng)歷1個(gè)月缺氧培養(yǎng)后，再進(jìn)行厭氧脅迫后生長，耐缺氧脅迫物種與不耐缺氧脅迫物種的區(qū)別是：耐缺氧植株能增加體內(nèi)SOD含量，進(jìn)而抵擋體內(nèi)過氧化物產(chǎn)生的潛在傷害［19］。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明水淹處理植株CAT，SOD和POD都隨著水淹深度和水淹持續(xù)時(shí)間的增加而增加，且其值都比未淹對(duì)照植株高。本試驗(yàn)中，GR和APX在水淹處理植株中都增加了，且在不同程度的水淹脅迫處理中存在著顯著差異（P＜0.05）。他們的增加確保了被淹植株體內(nèi)活性氧分子的解毒和還原型抗壞血酸的再生。抗壞血酸可以直接參加過氧化物，羥氫氧基和單線態(tài)氧毒性的清除，同時(shí)，他還可以作為輔酶在植株體內(nèi)發(fā)揮作用［20］。

3.2 碳水化合物含量的變化

碳水化合物的可利用性是維持植株旺盛發(fā)酵代謝所必須的［21，22］。厭氧或缺氧脅迫導(dǎo)致植株受傷的一個(gè)可能原因是體內(nèi)碳水化合物饑餓［23］。因此在厭氧或缺氧條件下，耐淹基因型能夠保持植株足夠的易于利用的可溶性糖的供應(yīng)；相反地，厭氧敏感型物種就不具備這種能力。SuSy是厭氧條件下負(fù)責(zé)植株體內(nèi)蔗糖水解成果糖和葡萄糖的主要酶類［24］。大量研究報(bào)道了碳水化合物在許多植物耐淹能力中的作用［23－26］。研究結(jié)果因植物基因型，脅迫的程度和脅迫持續(xù)時(shí)間以及被研究的組織不同而存在差異。本試驗(yàn)研究了經(jīng)受不同深度水淹脅迫的雙穗雀稗莖和根的可溶性糖和淀粉含量隨不同水淹持續(xù)時(shí)間的變化情況。被淹雙穗雀稗植株莖和根的可溶性糖和淀粉一致地隨著水淹持續(xù)時(shí)間的遞增而遞減。水淹深度越大的處理，植株莖和根的可溶性糖和淀粉含量越低，且隨水淹持續(xù)時(shí)間的遞增其下降幅度也相應(yīng)增大。盡管沒對(duì)植株體內(nèi)與糖類代謝相關(guān)酶的活性進(jìn)行測定，但從可溶性糖和淀粉含量的變化趨勢可以初步說明，水淹雙穗雀稗植株體內(nèi)的淀粉能很好的水解成植株厭氧代謝所需的可溶性糖形式。受淹植株能成功的運(yùn)用體內(nèi)的糖酵解底物可溶性糖，生產(chǎn)維持植株生長或生存所需的能量，從而捍衛(wèi)其耐水淹能力。在遭受長期不同水淹深度的水淹脅迫后，其回歸正常的生長環(huán)境后能快速的恢復(fù)生長并迅速長成新的植株，為下一階段的逆境脅迫奠定好能量供應(yīng)基礎(chǔ)。有關(guān)水淹脅迫雙穗雀稗植株體內(nèi)可溶性糖類的代謝過程和分子機(jī)理值得做深入研究。

3.3 季節(jié)對(duì)植株耐淹能力的影響

在夏季，水甜茅（Glyceriamaxima）分離的根狀莖完全抗缺氧的時(shí)間少于1周。在夏季高溫缺氧的條件下，4 d內(nèi)植株就會(huì)消耗體內(nèi)總非結(jié)構(gòu)性碳水化合物儲(chǔ)量的50%［27］。相比之下，在22℃的實(shí)驗(yàn)室條件下，越冬地下莖可以生存3周，毫無疑問在野外條件下可以生存更長時(shí)間。耐厭氧脅迫季節(jié)依賴性的生理基礎(chǔ)目前還沒有充分的理解，可能與冬天植株體內(nèi)高碳水化合物儲(chǔ)量和越冬器官低的代謝活力有關(guān)。以植株在回到正常環(huán)境中生長后能否長出新的莖的能力為檢測標(biāo)準(zhǔn)，冬天黃菖蒲單個(gè)根狀莖在厭氧條件下的最大生存時(shí)間是65d，夏天大概是50d［23］。根據(jù)三峽水庫的水淹節(jié)律，本試驗(yàn)中植株的水淹時(shí)間主要是冬季，這為植株降低能耗，抵抗更長時(shí)間的水淹脅迫奠定了好的基礎(chǔ)。但就雙穗雀稗植株在夏季是否具備如此強(qiáng)的耐水淹能力仍需進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

1）從抗氧化酶的保護(hù)機(jī)制來看，本試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持在厭氧脅迫條件下，植株通過包括涉及CAT，SOD，POD，GR和APX等多種抗氧化酶共同作用來保護(hù)植株免受活性氧分子的毒害。這些數(shù)據(jù)表明根系的抗氧化酶系統(tǒng)在雙穗雀稗抵御和忍耐長期水淹脅迫中起著至關(guān)重要的作用。總體來說，抗氧化酶活性升高水平與遭受的脅迫程度呈正相關(guān)，植株的抗氧化酶系統(tǒng)受各種各樣復(fù)雜的環(huán)境因子所共同調(diào)節(jié)著。

2）水淹雙穗雀稗植株體內(nèi)的淀粉能很好的水解成植株厭氧代謝所需的可溶性糖形式。受淹植株能成功的運(yùn)用體內(nèi)的糖酵解底物可溶性糖，生產(chǎn)維持植株生長或生存所需的能量，從而捍衛(wèi)其耐水淹能力。

3）根據(jù)三峽水庫的水淹節(jié)律，本試驗(yàn)中植株的水淹時(shí)間主要是冬季，這為植株降低能耗，抵抗更長時(shí)間的水淹脅迫奠定了好的能量基礎(chǔ)。

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