外源一氧化氮對滲透脅迫下黑麥草幼苗光合和生物發光特性的影響

劉建新，王金成，王瑞娟，賈海燕

（隴東學院生命科學與技術學院 甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室，甘肅 慶陽745000）

土壤鹽漬化和干旱是影響農業生產重要的逆境因子［1］。干旱和鹽害引起的滲透脅迫會導致植物氣孔關閉［2］，光合電子傳遞受抑［3］，光能利用率降低［4］，光合機構破壞［5］。黑麥草（Loliumperenne）是目前我國栽培面積最大的禾本科優質牧草和草坪草，對保障家畜飼草供應和維持生態平衡起著極其重要的作用。隨著全球氣候變暖，土壤鹽漬化和淡水短缺加劇，滲透脅迫已成為限制黑麥草生產的重要生態因子之一，探討提高其適應滲透脅迫的有效途徑具有重要意義。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是生物體中一種重要的信號分子，在植物響應逆境脅迫的應答中發揮著重要作用［6］。研究表明，干旱脅迫下，NO 參與調控小麥（Triticumaestivum）氣孔的關閉［7］，提高核桃（Juglansregia）的光能轉換效率［8］。鹽脅迫下，NO可緩解黃瓜（Cucumissativus）葉肉細胞光合活性的下降［9］，提高番茄（Lycopersiconesculentum）的光合速率［10］。缺鐵時，NO能促進玉米（Zeamays）類囊體膜色素蛋白復合體的裝配，引起電子傳遞速率增加和光合活性增強［11］。外源NO對滲透脅迫下黃瓜［12］和小麥［13］種子的萌發具有顯著的促進作用，并可緩解滲透脅迫對紅三葉（Trifolium）幼苗生長的抑制和氧化損傷［14］。然而，NO對滲透脅迫下黑麥草光合和生物發光特性影響的研究未見報道。本研究以牧草型多年生黑麥草為材料，分析NO供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）對滲透脅迫下光合色素含量、氣體交換和葉綠素熒光參數及生物發光的影響，以期為NO緩解牧草滲透脅迫傷害提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料培養

試驗于2010年4－8月在甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室進行。將黑麥草品種‘Oupec’的種子（購自百綠集團北京代理處）消毒、催芽后，選露白一致的播種在裝有珍珠巖的塑料缽（直徑20 cm，高22cm）中，每缽播約200粒，澆足水后置生物科技園日光溫室培養。出苗后每隔2d澆一次1/4Hoagland營養液，常規管理。幼苗三葉一心時，選一致壯苗用1/2Hoagland營養液培養，1周后換成完全營養液，每3d更換1次營養液，用電動氣泵24h通氣，當植株具5～6片葉時進行處理。

1.2 試驗設計

試驗首先在10%，15%，20%和25%濃度的聚乙二醇6000（polyethylene glycol 6000，PEG6000）滲透脅迫下分別添加50或100μmol/L SNP［Na2Fe（CN）5NO］處理幼苗，以葉片質膜相對透性為指標，篩選出進行后續試驗的PEG6000濃度為15%，SNP濃度為100μmol/L。

由于SNP的分解產物除NO外，還有NO2－/NO3－和Fe（CN）52－陰離子［7］，所以在試驗中加入一定濃度的NaNO3/NaNO2和Na3Fe（CN）6（后者也是SNP的相似物，但二者均不產生NO）作為相關對照。試驗設6個處理：1）對照，Hoagland營養液；2）15%PEG6000；3）15%PEG6000＋100μmol/L SNP；4）15%PEG6000＋100 μmol/L NaNO2＋100μmol/L NaNO3（其中 NaNO2＋NaNO3以 NOx－表示）；5）15%PEG6000＋100μmol/L Na3Fe（CN）6；6）15%PEG6000＋100μmol/L SNP＋0.1%Hb（牛血紅蛋白 Hb，NO的清除劑），分別用CK、PEG、PEG＋SNP、PEG＋NOx－、PEG＋F、PEG＋SNP＋Hb表示，各處理液用Hoagland溶液配制。每個處理重復4次，隨機排列。處理液每天更換1次，用低濃度HCl或KOH調節pH至5.5±0.2。溫室內平均光強620 μmol/（m2·s），晝/夜溫度（28±5）℃/（21±3）℃，濕度60%～75%，每天照光約12h，處理6d后取樣進行分析測定。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 光合色素含量的測定 按李合生［15］的方法，稱取葉片鮮樣0.10g，加入10mL 80%丙酮研磨提取并定容至50mL。過濾，用分光光度計測定濾液A663、A646和A470值，計算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。

1.3.2 光合氣體交換參數的測定 采用CIRAS－2型光合測定系統（PP－systems，英國）在9：00－11：00（晴）測定幼苗倒數第2～3片功能葉的凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、蒸騰速率（transpiration rate，Tr）、氣孔導度（stomatal conductance，Gs）和胞間 CO2濃度（intercellular CO2concentration，Ci）。氣孔限制值（stomatal limited value，Ls）由公式Ls＝1－Ci/Ca（Ca為大氣中CO2濃度）計算得出。測定時葉室內源光強為600μmol/（m2·s），溫度25℃，O2含量21%，CO2濃度為360μmol/mol。

1.3.3 葉綠素熒光參數的測定 采用FMS－2型脈沖調制式熒光儀（Hansatech，英國）測定和計算暗適應30min后幼苗倒數第2～3片功能葉的初始熒光（initial fluorescence，Fo）、最大熒光（maximal fluorescence，Fm）及光系統Ⅱ（photosystem Ⅱ，PSⅡ）最大光化學效率（maximal photochemical efficiency，Fv/Fm）＝（Fm－Fo）/Fm，再測定光強為6 000μmol/（m2·s）下的穩態熒光（steady－state fluorescence，Fs）、最大熒光（Fm′）和最小熒光（minimum fluorescence，Fo′），并計算光適應下 PSⅡ實際光化學效率（actual photochemical efficiency of PSⅡ，ΦPSⅡ）＝（Fm′－Fs）/Fm′，光化學猝滅（photochemical quenching，qP）＝（Fm′－Fs）/（Fm′－Fo′）、非光化學猝滅（non－photochemical quenching，NPQ）＝Fm/Fm′－1［16］。用（1－qP）表示PSⅡ的激發壓，反映PSⅡ的關閉程度［17］。

1.3.4 超弱發光強度的測定 采用中國科學院生物物理研究所研制的超弱發光儀測定。取幼苗倒數第2～3片功能葉0.5g左右，在光強10μmol/（m2·s）白熾燈照射5min后立即放入測量杯中測量超弱發光（ultraweak luminescence，UWL）強度。測量參數：電壓800V，標準光源發光強度7 000counts/s。本底強度5counts/s，采樣時間200s，采樣間隔1s。樣品測定在暗室及恒溫（25±1）℃、恒濕（相對濕度75%±2%）條件下進行。

1.3.5 葉片熒光強度的測定 采用日立F－4500熒光儀測定幼苗倒數第2～3片功能葉的熒光強度。測定條件為激發光（excitation light，EX）波長440nm，發射光（emitted light，EM）波長500～700nm，縫寬EX/EM 為10.0 nm/5.0nm，掃描速度12 000nm/min。

1.3.6 葉片磷光強度的測定 采用日立F－4500熒光儀測定幼苗倒數第2～3片功能葉的磷光強度。測定時EX波長為210nm，EM 波長為400～500nm，縫寬EX/EM 為10.0nm/5.0nm，掃描速度240nm/min。

1.4 統計分析

所有指標測定至少重復3次，結果以平均值±標準誤表示，采用SPSS 16.0軟件方差分析，Duncan法多重比較（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 外源NO對滲透脅迫下黑麥草幼苗葉片光合色素含量的影響

與CK相比，PEG處理顯著提高了黑麥草葉片葉綠素a、葉綠素b含量和葉綠素a/b，降低了類胡蘿卜素含量（表1）；PEG＋SNP處理的葉綠素a、葉綠素b含量、葉綠素a/b和類胡蘿卜素含量分別比PEG處理提高了31.1%，19.8%，9.6%和40.9%；而增添 NO清除劑血紅蛋白處理（PEG＋SNP＋Hb）后，SNP的作用被消除。PEG＋NOx－和PEG＋F處理的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量及葉綠素a/b與單獨PEG處理無顯著差異。

表1 外源NO對滲透脅迫下黑麥草幼苗葉片光合色素含量的影響Table 1 Effects of exogenous NO on content of photosynthetic pigment in leaves of ryegrass seedlings under osmotic stress

2.2 外源NO對滲透脅迫下黑麥草幼苗葉片光合參數的影響

引起Pn降低的因素有氣孔限制和非氣孔限制。Farquhar和Sharkey［18］認為，當Pn和Ci同時減小，且Ls增大時，Pn的下降主要是由Gs的降低引起的；否則，Pn的下降應主要歸因于非氣孔限制。與CK相比，PEG處理后黑麥草葉片的Pn、Gs、Tr和Ls顯著降低，Ci明顯升高（表2）；PEG＋SNP處理顯著降低了PEG處理下Pn、Gs、Tr、Ls下降和Ci提高的幅度；PEG＋SNP＋Hb處理逆轉了SNP對上述光合參數的調節效應。與單獨PEG處理相比，PEG＋NOx－或PEG＋F處理對黑麥草幼苗各光合參數無顯著影響。由此表明，外源NO可緩解滲透脅迫下非氣孔限制引起的黑麥草Pn的降低。

表2 外源NO對滲透脅迫下黑麥草幼苗葉片光合氣體交換參數的影響Table 2 Effects of exogenous NO on photosynthetic gas exchange parameters in leaves of ryegrass seedlings under osmotic stress

2.3 外源NO對滲透脅迫下黑麥草幼苗葉片葉綠素熒光參數的影響

葉綠素熒光參數可反映環境因子對植物光合生理狀況的影響。Fv/Fm常用于度量PSⅡ原初光能轉換效率，反映PSⅡ利用光能的能力；ФPSⅡ反映了PSⅡ反應中心在有部分關閉情況下實際原初光能捕獲效率［19］；激發壓（1－qP）反映的是PSⅡ的關閉程度，它與PSⅡ反應中心電子受體，特別是QA的氧化還原狀態有關；NPQ反映的是PSⅡ天線色素吸收的光能不能用于光化學反應而以熱的形式耗散的部分［18］。與CK相比，PEG滲透脅迫降低了黑麥草葉片的Fv/Fm和ΦPSⅡ，提高了（1－qP）和NPQ（表3）；PEG＋SNP處理顯著提高了滲透脅迫下的Fv/Fm和ΦPSⅡ，降低了（1－qP）和 NPQ；PEG＋SNP＋Hb處理消除了SNP對滲透脅迫下Fv/Fm、ΦPSⅡ提高及（1－qP）、NPQ降低的作用；PEG＋NOx－或PEG＋F處理的上述葉綠素熒光參數與單獨PEG處理無顯著差異。表明NO能夠提高滲透脅迫下黑麥草葉片PSⅡ的光能利用效率。

表3 外源NO對滲透脅迫下黑麥草幼苗葉片葉綠素熒光參數的影響Table 3 Effects of exogenous NO on chlorophyll fluorescence parameters in leaves of ryegrass seedlings under osmotic stress

2.4 外源NO對滲透脅迫下黑麥草幼苗葉片生物發光強度的影響

生物發光強度可反映植物體內物質代謝和能量轉化的活躍程度。當體內活性氧積累時，其中的羥基自由基與細胞膜上的多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化連鎖反應，形成單線態氧（1O2），處于激發態的1O2退激回到基態時向外發射光子，形成UWL［20］。通常情況下，絕大多數的有機分子處于單線基態，當分子被激發到較高能級并經歷非輻射躍遷降落到第一電子激發單重態的最低振動能級后，部分分子會回到基態而產生熒光，另一部分分子則經歷非輻射的系間竄越到達亞穩的第一電子激發三重態，在三重態逗留后，再發生輻射躍遷下降到基態的各振動能級而發射磷光，組成蛋白質的某些氨基酸分子可發生能級躍遷產生磷光［21］。黑麥草幼苗在PEG處理下葉片的UWL強度、熒光強度和磷光強度分別較CK提高了50.4%，26.1%和50.3%（圖1）；PEG＋SNP處理比PEG處理下的UWL強度、熒光強度和磷光強度分別降低了30.1%，15.6%和20.4%；增添NO清除劑處理（PEG＋SNP＋Hb）后SNP對3種生物發光的調節作用消失。PEG＋NOx－或PEG＋F處理與PEG處理相比，UWL強度和熒光強度無顯著差異，而磷光強度明顯增加。表明NO可能參與了滲透脅迫下黑麥草幼苗活性氧清除或防御蛋白質結構破壞的調控。

3 討論

光合色素參與植物光能的吸收、傳遞和轉化，葉綠素a/b可反映類囊體的垛疊程度，類囊體的垛疊程度越高，光抑制越不容易發生，植株抵御逆境脅迫的能力就越強［22，23］。本試驗表明，在15%PEG6000滲透脅迫下，施用100μmol/L SNP顯著提高了黑麥草幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量及葉綠素a/b，而添加血紅蛋白Hb后SNP的效應被消除；施用NOx－和Na3Fe（CN）6均未顯著改變滲透脅迫下光合色素的含量。SNP是NO常用的一種供體，0.5mmol/L SNP約能釋放2μmol/L的 NO［24］。NOx－是 NO的分解產物，Na3Fe（CN）6是SNP的相似物或分解產物，兩者均不能產生NO，Hb是NO的清除劑。因此，可以得出SNP釋放的NO提高了滲透脅迫下黑麥草葉片光合色素的含量和類囊體的垛疊程度，這與邵瑞鑫和上官周平［25］對受旱小麥的研究結果類似，其原因可能與NO能夠促進葉綠體發育［11］有關。

光合作用的強弱可反映植株對逆境脅迫的抵抗能力［26］。干旱脅迫通過氣孔和非氣孔因素導致玉米光合速率下降［27］。本試驗表明，外源NO可緩解滲透脅迫下黑麥草非氣孔限制引起的Pn的降低（表2）。進一步的研究顯示，滲透脅迫下黑麥草葉片Fv/Fm和ΦPSⅡ顯著降低，1－qP和NPQ明顯提高（表3），表明滲透脅迫造成了PSⅡ反應中心的破壞，導致PSⅡ原初電子受體QA過度還原，激發能通過PSⅡ用于光化學過程的能量減少，光能利用率下降，光能過剩產生了光抑制［28］，為防止過剩光能對光合機構造成進一步傷害，加強熱耗散以保護PSⅡ的功能，這可能是黑麥草適應滲透脅迫的一種保護機制［29］。諸多研究表明，NO在逆境脅迫下植物光合器官功能的維持中發揮著重要的調控作用。如外源NO提高了干旱脅迫下苜蓿（Medicagosativa）幼苗的原初光能轉換效率和PSⅡ的潛在活性［30］，增加了受旱小麥PSⅡ反應中心開放的比例［25］，提高了強光脅迫下霍山石斛（Dendrobiumhuoshanense）PSⅡ過剩光能的非光化學耗散，緩解了光抑制破壞［31］。本試驗結果顯示，外源NO顯著緩解了滲透脅迫引起的黑麥草葉片Fv/Fm和ΦPSⅡ下降及1－qP和NPQ提高的幅度（表3），表明NO不僅可以減輕滲透脅迫對PSⅡ反應中心的損傷，維持PSⅡ的光化學活性，還可降低滲透脅迫下激發能的非光化學熱耗散。這可能也是NO緩解滲透脅迫對黑麥草葉片光合速率抑制的重要原因之一，但其作用機制有待進一步揭示。

植物UWL是與植物能量代謝相聯系的低水平光子輻射［21］。研究表明，植物葉片的UWL主要來自于葉綠體［32］，而葉綠體UWL可能主要來自類囊體膜上的光合電子傳遞鏈［33］，但也受活性氧的影響［32］。本研究中，滲透脅迫誘導黑麥草葉片UWL強度顯著增加（圖1），這與UWL產生的活性氧機制［34］相符合。外源NO降低了滲透脅迫下黑麥草葉片UWL強度，表明NO可能緩解了滲透脅迫對光合鏈電子傳遞的抑制，或增強了滲透脅迫下體內活性氧的清除能力，維持了類囊體膜結構和功能的完整性。滲透脅迫下黑麥草光能利用率的下降（表3），將產生過剩的激發能，多余的激發能會以光能或熱能的形式釋放，導致滲透脅迫下葉片熒光和磷光輻射的增強（圖1）及非光化學能量耗散的提高（表3）。外源NO顯著降低了滲透脅迫下黑麥草葉片熒光和磷光強度升高的幅度（圖1），減緩了滲透脅迫導致的非光化學能量耗散提高的幅度（表3）。表明NO可通過提高光能的利用效率，降低滲透脅迫誘導的過剩激發能對光合機構的破壞，從而提高滲透脅迫下黑麥草葉片的光合速率。

綜上所述，滲透脅迫限制了黑麥草幼苗光合機構功能的正常發揮，外源NO不僅能夠提高滲透脅迫下黑麥草葉片的光合色素含量，還可通過增加PSⅡ反應中心的開放比例，降低非光化學能量耗散和生物發光強度，提高光能利用效率，從而緩解滲透脅迫下非氣孔因素引起的黑麥草葉片光合速率的下降，提高植株光合機構對滲透脅迫的適應能力。

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