兩個海拔分布下紅砂葉片對滲透脅迫的生理響應

李朝周，左麗萍，李毅，焦健＊

（1.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州730070；3.慶陽市經(jīng)濟林木工作管理站，甘肅 慶陽745000；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學林學院，甘肅 蘭州730070）

紅砂（Reaumuriasoongorica）是我國荒漠草場中的建群植物和優(yōu)勢植物，作為良好的荒漠草場牧草和維持綠洲穩(wěn)定性的重要植物之一，紅砂具有較高的生態(tài)、經(jīng)濟和社會價值［1－3］。有關紅砂滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、光合生理及生長發(fā)育的研究已有報道［4－6］，但是關于紅砂在不同海拔及水分狀況下抗旱生理比較還缺乏系統(tǒng)研究。

在同一地域的不同海拔往往具有不同的生境因子，如不同的溫度、光照和降水等，這些不同會影響到植物本身的水分狀況、生長發(fā)育和抗性生理。當植物遭受到干旱脅迫時，植物細胞往往受到一定程度的滲透脅迫，并造成植物組織及細胞失水，水勢和相對含水量下降，并有可能帶來細胞內(nèi)一系列的變化，如活性氧、自由基產(chǎn)生的增加、細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的累積和細胞膜選擇透性的破壞等［7，8］。活性氧、自由基在低濃度下可作為第二信使，調(diào)節(jié)細胞間的信號傳導和細胞內(nèi)代謝，但是當活性氧的濃度超過一定“閾值”時，則能對細胞膜系統(tǒng)造成傷害；當然植物在長期的進化過程中也形成了清除活性氧、自由基的機制，如低分子的抗氧化劑與抗氧化酶系統(tǒng)，如抗壞血酸、還原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶等［8，9］。近幾十年來，許多研究表明用PEG溶液進行滲透脅迫可以在一定程度上模擬干旱脅迫，而處理方式除對整體植物進行根系的PEG溶液滲透脅迫外，離體的葉片也被應用于滲透脅迫，并具有處理均一和便于掌控脅迫程度的優(yōu)點，因此滲透脅迫在植物逆境生理研究中廣為采用［10－13］。

植物的抗旱性是由多種因素相互作用而構成的一個復雜的綜合性狀，其中每一個因素都與抗旱性本質(zhì)之間存在著一定的聯(lián)系，而各因素之間也存在著一定的關聯(lián)。植物抵御或適應干旱的途徑多種多樣，用單一指標很難準確評定植物的抗旱性，因此有必要探討滲透脅迫下抗性相關各生理指標變化間的關聯(lián)。

為此，本實驗以蘭州市九州臺山上、山下天然分布的紅砂枝條為實驗材料，通過用PEG－6000溶液滲透脅迫，測定其葉片在不同脅迫程度下相關生理指標的變化及其關聯(lián)，探討不同海拔紅砂葉片對滲透脅迫生理響應的差別及機制，旨在為干旱半干旱地區(qū)荒漠化防治及荒山造林實踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和處理

本實驗所用材料取自蘭州市九州臺山上（海拔1 800m）、山下（海拔1 500m）自然生長且3齡以上的紅砂植株，取生長整齊一致的枝條，從各枝條頂端剪取10cm左右枝段插于PEG－6000溶液進行滲透脅迫處理。PEG－6000溶液濃度分別為10%，20%，30%（質(zhì)量百分比濃度），以蒸餾水作為對照，于處理12和24h時，取其葉片進行各項生理生化指標的測定。滲透脅迫處理在光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行，其溫度為（22±1）℃，相對濕度為55%，持續(xù)24h光照，光照強度為120μmol/（m2·s）。實驗于2008年7－8月進行，各項指標測定均重復3～5次。

1.2 相關指標測定方法

1.2.1 相對含水量（RWC） 烘干法［14］測定。

1.2.2 植物組織水勢 小液流法［14］測定。

1.2.3 自由水 （Vs）和束縛水 （Va）含量 參照郝再彬等［15］的方法測定。

1.2.4 丙二醛（MDA）含量 參照Benavides等［16］的方法測定。

1.2.5 脯氨酸含量 茚三酮比色法［14］測定。顯色后在520nm波長處測定光密度值，通過標準曲線計算游離脯氨酸含量。

1.2.6 可溶性糖含量 采用蒽酮比色法［14］測定。

1.2.7 O2－·產(chǎn)生速率 參照王愛國和羅廣華［17］的方法，測定環(huán)境中的光照強度為120μmol/（m2·s）。

1.2.8 抗氧化酶活性 超氧化物歧化酶（SOD）采用Spychalla和Desborough［18］的方法測定，用氮藍四唑法以抑制氯化硝基氮藍四唑（NBT）光化還原50%為一個酶活性單位；過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性測定采用Lin和Wang［19］的方法。其中POD活性測定基于愈創(chuàng)木酚的氧化，在470nm測定，以每克植物鮮重中每分鐘所含酶活性單位（U）表示；過氧化氫酶（CAT）活性用紫外吸收法，以240nm每分鐘光吸收值減少0.01為一個酶活性單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理及相關性分析，取P＜0.05為顯著相關，P＜0.01為極顯著相關。各數(shù)據(jù)均用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 滲透脅迫對紅砂葉片水分生理特征的影響

蘭州市九州臺山上及山下紅砂葉片相對含水量和水勢都隨PEG－6000處理時間的延長和脅迫程度的加強呈下降趨勢（表1）。在30%的PEG處理12h時，山上、山下紅砂葉片相對含水量分別比對照降低了48.94%，28.22%，處理24h時分別下降了57.96%，47.72%。在30%的PEG處理12h時山上、山下紅砂葉片水勢分別比對照降低了0.13和0.88MPa，在處理24h時分別降低了0.26和1.01MPa。可見，山下生長的紅砂在受脅迫時持水能力較好。

表1 PEG－6000處理下紅砂葉片相對含水量及水勢變化Table 1 Changes in leaf relative water content and water potential of R.soongoricaunder PEG－6000treatment

隨著PEG－6000滲透脅迫程度的加強和脅迫時間的延長，紅砂葉片自由水含量逐漸減少，束縛水含量增多，自由水/束縛水的值不斷減小（表2）。用濃度30%的PEG處理12h時，山上、山下紅砂自由水/束縛水的值分別比對照降低了0.94，0.60；處理24h時分別下降了1.00，0.60。由此可見山下紅砂比山上紅砂有更強的耐滲透脅迫的能力。

表2 PEG－6000處理下紅砂葉片自由水、束縛水及自由水/束縛水的變化Table 2 Changes in leaf Vs，Va and Vs/Va of R.soongoricaunder PEG－6000treatment

2.2 滲透脅迫對紅砂葉片MDA含量的影響

蘭州市九州臺山上、山下紅砂葉片MDA含量隨PEG滲透脅迫時間的延長和脅迫程度的加強呈上升趨勢，但上升的趨勢不同（圖1），用濃度30%的PEG處理12h時，山上、山下紅砂葉片MDA含量分別比對照提高了3.24和1.67μmol/g，處理24h時分別提高了4.08和2.88μmol/g。由此可見，山上紅砂葉片在受到滲透脅迫時，膜脂過氧化程度比山下紅砂葉片更為嚴重。

2.3 滲透脅迫對紅砂葉片O2－·產(chǎn)生速率的影響

隨PEG滲透脅迫時間的延長和脅迫程度的加強，蘭州市九州臺山上、山下紅砂葉片O2－·產(chǎn)生速率呈不斷增大趨勢，但增大的程度不同，用濃度30%的PEG處理12h時，山上、山下紅砂葉片O2－·產(chǎn)生速率分別比對照增大了174.94和167.93μmol/（min·g FW）；處理24h時分別增大了179.80和169.30μmol/（min·g FW）（圖2）。

圖1 PEG－6000處理對紅砂葉片丙二醛含量的影響Fig.1 Effect of PEG－6000treatment on MDA content in R.soongoricaleaf

圖2 PEG－6000處理對紅砂葉片O2－·產(chǎn)生速率的影響Fig.2 Effect of PEG－6000treatment on generating rate of O2－·in R.soongoricaleaf

2.4 滲透脅迫對紅砂葉片抗氧化酶活性的影響

試驗結果表明，在PEG滲透脅迫下紅砂葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性均高于對照，且隨脅迫時間的延長和脅迫程度的加強呈不斷增加趨勢；清除H2O2的2種重要的酶CAT和POD變化基本一致，在處理12h時，隨PEG濃度的升高，POD和CAT活性升高，但在處理24h時，隨PEG濃度的升高，POD和CAT活性先升高后降低（圖3）。SOD是一種誘導酶，受到底物濃度的誘導，說明干旱促進紅砂葉片O2－·的生成，誘導SOD活性增加，由SOD歧化O2－·產(chǎn)生的H2O2也必然增多，在脅迫后期POD和CAT活性均下降。

圖3 PEG－6000處理對紅砂葉片SOD、POD和CAT活性的影響Fig.3 Effect of PEG－6000treatment on SOD，POD and CAT activity in R.soongoricaleaf

2.5 滲透脅迫對紅砂葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

蘭州九州臺山上、山下紅砂葉片在PEG滲透脅迫下脯氨酸含量變化趨勢相同（圖4），在不同PEG濃度滲透脅迫處理12h時山上、山下紅砂葉片脯氨酸含量均呈增加趨勢，處理24h時山上、山下紅砂葉片脯氨酸含量在PEG濃度為10%和20%時上升較快，而PEG濃度為30%時有所下降。山下紅砂葉片脯氨酸含量變化較為劇烈。隨滲透脅迫時間的延長和脅迫程度的加強，紅砂葉片可溶性糖含量不斷的增加，但增加趨勢不同，10%的PEG處理紅砂葉片可溶性糖含量比對照變化較小，但高濃度的PEG處理下的紅砂葉片可溶性糖含量變化較大。隨著脅迫的進行，蘭州九州臺山下紅砂葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)隨脅迫進行變化較為劇烈。

2.6 滲透脅迫下紅砂葉片生理特征的相關性

滲透脅迫下，蘭州市九州臺山上、山下紅砂葉片水分指標RWC、水勢及自由水/束縛水均與MDA、O2－·產(chǎn)生速率、SOD活性和可溶性糖呈顯著或極顯著負相關（表3）；MDA與SOD活性呈極顯著負相關；O2－·產(chǎn)生速率與SOD活性呈顯著正相關，其余相關關系不顯著。

3 討論

束縛水含量是植物耐旱性的一個重要指標。束縛水比例增大，則細胞原生質(zhì)粘滯性及原生質(zhì)膠體親水性加強，有利于植物吸水和保持體內(nèi)水分，對提高植物耐旱能力有利，即自由水/束縛水（Va/Vs）小，則植物耐旱能力強［20］。本研究顯示蘭州市九州臺山下紅砂葉片相對含水量雖然低于山上的紅砂（表1），但自由水/束縛水下降（表2），這與不同海拔造成的氣候條件和干旱程度密切相關，也可能是本研究探討的不同海拔紅砂葉片對滲透脅迫生理反應差異的重要原因。

圖4 PEG－6000處理對紅砂葉片脯氨酸及可溶性糖含量的影響Fig.4 Effect of PEG－6000treatment on proline and soluble sugar content in R.soongoricaleaf

表3 PEG－6000處理下紅砂葉片生理特征的相關性Table 3 Correlations among physiological indexes of R.soongoricaleaf under PEG－6000treatment

滲透調(diào)節(jié)是植物應對水分脅迫的重要措施。有研究顯示檉柳屬（Tamarix）植物水勢越低，持水力越強，抗旱性越強［21］。本研究的結果表明，滲透脅迫導致紅砂葉片自由水含量、水勢和相對含水量降低（表1），但九州臺山上生長的紅砂由于其葉片束縛水含量相對較高（表2），隨PEG滲透脅迫的加深表現(xiàn)出了較強的保水能力，如在30% 的PEG－6000溶液滲透脅迫24h山上紅砂葉片含水量比山下紅砂高（表1）。

植物在逆境條件下的膜脂過氧化反應和保護酶系統(tǒng)SOD、POD、CAT等活性的變化已廣泛應用于植物對逆境的反應機理研究［22］。MDA是植物細胞脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，其含量的高低在一定程度上能反映膜脂過氧化水平和膜結構的受害程度。一般認為植物在脅迫條件下細胞膜的受損與超氧自由基增加引起膜脂過氧化有關［9，22，23］。SOD、CAT和POD等酶類是細胞抵御活性氧傷害的重要保護酶，它們在清除超氧自由基、過氧化氫和過氧化物以及阻止或減少自由基產(chǎn)生等方面起著重要作用［9］。超氧化物歧化酶以催化O2－·發(fā)生歧化作用起到清除O2－·的解毒作用，超氧化物歧化酶將O2－·歧化產(chǎn)生的H2O2由細胞內(nèi)CAT和POD清除。脅迫條件下保護酶系統(tǒng)活性上升和下降與植物的抗旱性強弱有關。抗旱強的品種在逆境條件下能使保護酶活力維持在一個較高水平，有利于清除自由基，降低膜脂過氧化水平，從而減輕膜傷害程度［16］。本研究表明，PEG滲透脅迫導致紅砂葉片MDA含量增多，在PEG滲透脅迫下SOD，POD和CAT活性增強，上述結果說明滲透脅迫一方面刺激紅砂葉片產(chǎn)生更多的自由基，加快脂質(zhì)過氧化，導致MDA含量增加，另一方面刺激了保護酶系統(tǒng)（SOD、POD和CAT）活性的增強，加快自由基的清除，減輕膜脂過氧化程度。在PEG溶液的滲透脅迫下，紅砂葉片水分虧缺隨PEG脅迫加劇而逐漸加重，水勢不斷的降低（表1），由此造成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）積累（圖1），O2－·產(chǎn)生速率的大幅度增加（圖2），從而誘發(fā)超氧化物歧化酶（SOD）活性增強（圖3a）。在適度脅迫下，植物對環(huán)境脅迫做出響應，POD和CAT活性增強（圖3b～c），脯氨酸和可溶性糖含量增加（圖4a～b），但進一步脅迫導致POD和CAT活性下降（圖3b～c），紅砂葉片內(nèi)保護酶系統(tǒng)平衡破壞。PEG滲透脅迫下，蘭州市九州臺山上、山下紅砂葉片滲透脅迫下各生理變化相關分析表明，紅砂葉片水分指標RWC、水勢及自由水/束縛水均與MDA含量及O2－·產(chǎn)生速率呈顯著負相關；SOD活性與O2－·產(chǎn)生速率呈顯著正相關（表3），可見滲透脅迫下各生理指標的變化密切關聯(lián)。

總之，對于九州臺山上和山下生長的2組材料，在PEG脅迫加深的條件下，山下的紅砂葉片具有較強的滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化能力，其脂質(zhì)過氧化的水平也較低，產(chǎn)生這些生理響應差別的主要因素可能為2組材料水分狀況的差別，即山下紅砂葉片束縛水含量較高，在深度脅迫下的保水性較好，且在通常情況下較低的葉片含水量和水勢也可能是其較強抗?jié)B透脅迫能力的重要原因之一。

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