節(jié)裂角茴香幾種溶劑提取物對粘蟲的作用方式研究

張君霞，楊曉華，楊順義，張新虎，沈慧敏＊

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學林學院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070）

節(jié)裂角茴香（Hypecoumleptocarpum）系罌粟科（Papaveraceae）角茴香屬（Hypecoum）一年生植物，主要分布在我國西北地區(qū)，在甘肅省的大部分天然草地中都有分布，魏有海等［1］報道，免耕溝播油菜（Brassica campestris）田節(jié)裂角茴香為3級以上危害雜草，家畜誤食后常引起中毒。

罌粟科植物因為罌粟（Papaversomniferum）而聞名于世，從該科植物中篩選具有殺蟲活性的有毒物質(zhì)，用以開發(fā)植物源農(nóng)藥具有先天優(yōu)勢，但從目前文獻報道來看，殺蟲植物中研究較多的有楝科（Meliaceae）、豆科（Leguminosae）、瑞香科（Thymelaeaceae）、菊科（Compositae）等，相對罌粟科研究少之又少，僅見報道有小果博落回（Macleayamicrocarpa），如葉道年［2］報道了博落回有強大的殺蛆作用，將博落回莖葉放入糞坑4～5d，莖葉腐爛后就能把蠅蛆全部殺死；張勝菊等［3］的研究表明，博落回石油醚抽提物200倍液對黃守瓜（Aulacophorafemoralis）和菜青蟲均有較好的防效，尤其是防治活動能力強的害蟲效果更好。石進樣等［4］的試驗表明，博落回的乙醇粗提物和水提物對菜蚜（Lipaphiserysimi）有很強的毒殺作用；王興林等［5］的研究表明小果博落回丙酮提取物對棉鈴蟲（Heliothisarmigera）生長發(fā)育具有一定的抑制作用。另外，罌粟科角茴香屬，目前主要以藏藥和化感作用研究為主［6－10］，如雷國蓮等［8］研究發(fā)現(xiàn)，角茴香全草含角茴香堿、角茴香酮、原阿片堿、直立角茴香堿；郭潔等［9］研究表明，角茴香正丁醇提取物對肝細胞水腫變性、胞漿疏松及壞死均有明顯保護作用，還通過小鼠熱板試驗可知，其具有一定的鎮(zhèn)痛作用；李普衍［10］研究表明，角茴香水煎劑對人型結(jié)核桿菌及枯草桿菌有抑制作用，其乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、白喉桿菌、枯草桿菌、霍亂弧菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌及常見致病菌均有較強的抑制作用，其氯仿提取物發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎作用；王俊儒等［11］研究發(fā)現(xiàn)，角茴香水浸液含有化感物質(zhì)，可引起生菜（Lactucasativa）幼苗體內(nèi)過量活性氧的產(chǎn)生，進而造成了其生長弱小，競爭力削弱。

本項目組成員在對天祝草地有毒殺蟲植物進行篩選過程中，發(fā)現(xiàn)了節(jié)裂角茴香具有殺蟲活性［12－13］，但有關(guān)其殺蟲作用方式還未見報道［14－20］。因此，本研究以采自甘肅省天祝縣抓喜秀龍?zhí)烊徊輬龅墓?jié)裂角茴香為材料，采用2種方法，4種溶劑提取，獲得了8種提取物，對粘蟲進行了生物活性測定，以明確節(jié)裂角茴香對粘蟲的作用方式，為其開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物 節(jié)裂角茴香于2008年5月下旬，采集于甘肅天祝抓喜秀龍?zhí)烊徊莸亍?/p>

1.1.2 供試昆蟲 粘蟲（Mythimnaseperata）由甘肅農(nóng)業(yè)大學農(nóng)藥系實驗室提供。飼養(yǎng)條件：（25±1）℃，濕度（80±7）%，光照12h。用玉米葉人工飼養(yǎng)，選擇大小一致的3齡幼蟲供試。

1.1.3 試劑 乙醇、甲醇、正己烷、二氯甲烷，均為分析純。

1.2 植物提取物的制備

將采回的節(jié)裂角茴香植物洗凈，置于通風處陰干，一部分植物樣品陰干后從根莖基部5cm處剪開，分為地上部分和地下部分，分別粉碎后過40目篩（孔徑0.37mm），密封并置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 恒溫振蕩法 2011年4月，取經(jīng)粉碎植物樣品4份，每份25g于具塞三角瓶中，分別加入100mL四種溶劑，密封后于30℃恒溫振蕩器每隔2h振蕩2h，共振蕩12h。經(jīng)布氏漏斗減壓抽提后繼續(xù)倒入100mL相同溶劑，采用相同方法振蕩，重復3次。合并3次提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，定容至100mL，得到節(jié)裂角茴香的4種溶劑的提取物，最終提取物質(zhì)量濃度為1g/mL（即1mL提取物中含1g干物質(zhì)樣品），將4種溶劑提取液置于三角瓶中，密封后置于0～4℃的冰箱中保存?zhèn)溆茫?2－15］。

1.2.2 索氏抽提法 2011年4月，取節(jié)裂角茴香樣品4份，每份50g于濾紙筒中，分別用4種溶劑在索氏抽提器中提取36h，4種溶劑提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至少量后轉(zhuǎn)入刻度試管中，用溶劑定容為1g/mL，密封，于0～4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 植物提取物對粘蟲的作用方式測定方法

1.3.1 植物提取物對粘蟲的拒食作用測定方法 將玉米葉打成直徑為1.5cm的圓形葉碟，用移液槍點滴30 μL 8種植物提取物于葉碟，待溶劑揮發(fā)后放入保濕培養(yǎng)的培養(yǎng)皿，再接入饑餓3h的3齡幼蟲2頭，設相應溶劑及清水為對照，每處理10頭試蟲，重復3次。隨時補充處理葉碟［8］。于處理24，48，72h后分別統(tǒng)計取食葉面積并計算拒食率［12－13］。

1.3.2 植物提取物對粘蟲的觸殺作用測定方法 用微量點滴器將1μL 8種植物提取物的藥液點滴于3齡粘蟲前胸背板處，以點滴等量相應溶劑及清水為對照。每處理10頭粘蟲，重復3次。將處理過的粘蟲置于以濾紙保濕培養(yǎng)皿中，在恒溫培養(yǎng)箱（溫度24～26℃，濕度80%，光照12h）內(nèi)以新鮮玉米葉片飼喂，并于24，48，72h后清理并記錄各組的死亡率，計算校正死亡率［8－11，13］。

1.3.3 植物提取物對粘蟲的胃毒作用測定方法 參照慕立義［21］的改進夾毒葉片法，在直徑為1.5cm的玉米葉碟上點滴30μL藥劑，以點滴等量相應溶劑及清水為對照，待溶劑揮發(fā)后，將處理過玉米葉碟置于以濾紙保濕培養(yǎng)皿中，每皿接入2頭試蟲，每處理10頭粘蟲，重復3次。于處理后24，48，72h記錄各組的死亡率，計算校正死亡率。

1.3.4 植物提取物對粘蟲的生長發(fā)育抑制作用測定方法 參照胡美英［22］方法，將新鮮的玉米葉片浸入待測樣品中2～3s，以浸漬相應溶劑及清水為對照，待藥劑揮發(fā)干后，放入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，然后接入已稱重的饑餓4h的粘蟲3齡幼蟲，每皿1頭，共處理10頭。處理前稱體重，處理后每隔24h稱1次體重，更換新鮮處理葉碟飼喂，48h后換新鮮無毒的葉片，繼續(xù)飼喂至化蛹，記錄死亡蟲數(shù)、蛹重和化蛹率，計算生長發(fā)育抑制率［8－12，20］。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Excel軟件進行統(tǒng)計，用SPSS 17.0軟件Duncan法進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 8種節(jié)裂角茴香提取物對粘蟲的拒食作用

8種節(jié)裂角茴香提取物對粘蟲3齡幼蟲的拒食作用測定結(jié)果見表1。8種提取物對粘蟲均有較高的拒食作用。索氏抽提法提取物對粘蟲的拒食活性略高于恒溫振蕩法，且2種方法的乙醇提取物對粘蟲拒食活性最高，處理48h后，拒食率分別為85.25%和90.78%，甲醇提取物分別為80.25%和84.67%，二氯甲烷提取物分別為79.05%和83.29%，僅次于甲醇提取物，正己烷最低，拒食率為73.25%和74.67%。

2.2 8種節(jié)裂角茴香提取物對粘蟲的觸殺作用

8種節(jié)裂角茴香提取物對粘蟲3齡幼蟲的觸殺作用測定結(jié)果見表2。8種節(jié)裂角茴香提取物對粘蟲的觸殺活性較弱，最高的是索氏提取法獲得的乙醇提取物，48h校正死亡率為33.33%；其他7種提取物的較正死亡率均在30%以下。

2.3 8種節(jié)裂角茴香提取物對粘蟲的胃毒作用

8種節(jié)裂角茴香提取物對粘蟲3齡幼蟲的胃毒作用測定結(jié)果見表3。8種節(jié)裂角茴香提取物24和48h對粘蟲的胃毒作用都不明顯，胃毒活性最強的是索氏抽提法的乙醇提取物，48h校正死亡率為23.3%。其次是甲醇和二氯甲烷提取物，48h校正死亡率均為16.7%。

表1 8種節(jié)裂角茴香提取物對粘蟲的拒食作用Table 1 Anti－feeding activities of 8 H.leptocarpumextracts against M.seperata

表2 8種節(jié)裂角茴香提取物對粘蟲的觸殺作用Table 2 Contacting activities of 8 H.leptocarpumextracts against M.seperata

表3 8種節(jié)裂角茴香提取物對粘蟲的胃毒作用Table 3 Stomach activities of 8 H.leptocarpumextracts against M.seperata

2.4 4種節(jié)裂角茴香提取物對粘蟲的生長發(fā)育抑制作用

通過以上3種作用方式的測定，可知索氏抽提法及乙醇是節(jié)裂角茴香殺粘蟲的最佳提取方法及溶劑。因此，對其生長發(fā)育抑制作用的測定及節(jié)裂角茴香不同部位拒食作用測定分別選用了最佳提取方法及溶劑獲得的提取物。

對粘蟲3齡幼蟲的生長發(fā)育抑制作用測定結(jié)果見表4。節(jié)裂角茴香4種溶劑提取物對粘蟲3齡幼蟲均有一定的生長發(fā)育抑制作用，其中甲醇和乙醇的抑制率最高，24h后抑制率分別為91.45%和89.82%，48h后以乙醇的生長發(fā)育抑制率最高，為87.00%。4種溶劑提取物的生長發(fā)育抑制率均隨著時間的延長而降低，其中以正己烷的提取物最為明顯，乙醇提取物的生長發(fā)育抑制率隨著時間的延長降低幅度較小，生長發(fā)育抑制作用較穩(wěn)定。經(jīng)4種提取物處理后的粘蟲與對照比較均表現(xiàn)為生長發(fā)育延緩，以乙醇及甲醇提取物的帶藥葉碟飼喂48h后，化蛹率最低，均為23.33%。

表4 4種節(jié)裂角茴香提取物對粘蟲的生長發(fā)育抑制作用Table 4 Growth inhibiting effects of 4 H.leptocarpumextracts against M.seperata

2.5 節(jié)裂角茴香不同部位提取物對粘蟲3齡幼蟲的拒食作用比較

以乙醇為提取溶劑，將節(jié)裂角茴香地上部分和地下部分用索氏抽提法提取，測定了2種提取物對粘蟲3齡幼蟲的拒食活性，比較了植株不同部位對粘蟲的殺蟲作用，結(jié)果見表5。節(jié)裂角茴香的地上部分乙醇提取物對粘蟲的拒食活性明顯高于地下部分，24和48 h拒食率分別為90.43%和94.67%，而地下部分醇提取物的拒食率僅為50.33%和56.00%。可見節(jié)裂角茴香對粘蟲的拒食活性物質(zhì)主要集中在地上部分。

表5 節(jié)裂角茴香不同部位提取物對粘蟲3齡幼蟲的拒食作用比較Table 5 Anti－feeding effects of different part of H.leptocarpumextracts against M.seperata

3 結(jié)論與討論

節(jié)裂角茴香殺粘蟲活性物質(zhì)最佳提取方法為索氏抽提法，最佳提取溶劑為乙醇，其次是甲醇、二氯乙烷，正己烷提取效果最差。同科植物博落回的相關(guān)研究表明，博落回根乙醇提取物對菜粉蝶（Pierisrapae）、亞洲玉米螟（Ostriniafurnacalis）和桃蚜（Myzuspersicae）幼蟲具有很強的生物活性［23］；博落回植株乙醇提取物對菜粉蝶5齡幼蟲24和48h的非選擇性拒食率分別為91.52%和92.06%［24］；王高學等［25］通過對氯仿、乙酸乙酯、丙酮和乙醇作為溶劑得到的提取物活性部位試驗，確定具有殺蟲活性的部位為氯仿提取。馮崗［26］研究表明，在供試的5種不同溶劑提取物中，氯仿和乙醇提取物對粘蟲3齡幼蟲和小菜蛾3齡幼蟲的拒食活性最高，說明小果博落回的主要殺蟲活性成分集中在氯仿和乙醇提取物。這與本文研究結(jié)果一致，由此可見：節(jié)裂角茴香殺蟲活性成分在加熱情況更易于提取、節(jié)裂角茴香殺蟲活性物質(zhì)集中在極性和弱極性部分，非極性物質(zhì)含量較少。

馮崗等［26－27］研究表明：小果博落回總生物堿對粘蟲、菜青蟲和小菜蛾主要表現(xiàn)為拒食和胃毒作用，而無明顯的觸殺和熏蒸作用，同時對粘蟲3齡幼蟲、菜青蟲5齡幼蟲、小菜蛾3齡幼蟲具有一定的生長發(fā)育抑制作用，對粘蟲還具有一定的殺卵作用；王亞維和尤民生［24］研究表明博落回植株乙醇提取物對菜粉蝶5齡幼蟲有很強的非選擇性拒食作用。這于本研究結(jié)果基本一致，即節(jié)裂角茴香提取物對3齡粘蟲的主要殺蟲作用方式表現(xiàn)為：強烈的拒食作用及生長發(fā)育抑制作用，觸殺及胃毒作用較弱。分析其拒食及生長發(fā)育抑制作用原因可能是由于取食含毒葉片引起幼蟲的營養(yǎng)條件變化、體內(nèi)代謝失調(diào)而使生長發(fā)育受抑制，導致蛹重降低，化蛹率下降，化蛹時間延緩，出現(xiàn)半蛹半蟲現(xiàn)象，或在化蛹前期死亡。同時，從以上結(jié)果可以看出，節(jié)裂角茴香的地上部分的殺蟲活性明顯高于地下部分，表明節(jié)裂角茴香的殺蟲物質(zhì)主要集中在地上部位。另外，有關(guān)節(jié)裂角茴香拒食活性物質(zhì)的分離、純化和鑒定還有待進一步研究。

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