人臍血CD34+造血干細胞的分離和體外擴增培養問題

王丹丹，賀雪萍，武文杰，李 茜，韓俊領

(協和干細胞基因工程有限公司，吉林長春300384)

干細胞(Stem Cells，SC)是一類多潛能細胞，還未充分分化，具有較強的自我復制能力。有研究表明臍帶血中含有大量的干細胞，無論是對外界刺激的反應還是增殖能力都比骨髓干細胞強。在體外生長培養中也顯示出優于骨髓干細胞的特點，比骨髓干細胞生長的更好，即更適合做體外擴增培養。本文通過對人臍血CD34+造血干細胞的分離以及體外培養的研究，探討其作為治療用種子細胞的可能性，現將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 UCB來源:人臍帶血由相關醫院婦產科提供。

1.1.2 儀器和藥品:使用的主要儀器包括細胞培養箱，超凈工作臺;細胞培養板，流式細胞儀;顯微鏡，照相機;電子天平，離心機;低溫冰箱等。

使用的藥品主要包括細胞因子 SCF、IL－3、IL－6、GCSF、EPO;青霉素、鏈霉素;NaCl、KCl;甲醇、乙醇;Na2HP04、KH2P04;Ficoll淋巴細胞分離液;胎牛血清;DMEM培養液。1.2 方法:采用胎盤娩出后采血法采集臍帶血，要求孕婦無產科，內科合并癥以及其他血液疾病。采血過程由助產士幫助完成。在無菌條件下抽取臍帶血，注入無菌采血袋后置于4℃保存。24 h內分離制備MNC懸液后用Isolex50免疫磁珠分離系統收集CD34+造血干細胞，用流式細胞儀檢測收集的CD34+純度后行體外擴增培養。通過血液涂片進行形態學觀察。根據細胞計數調整細胞懸液量，加入胎牛血清和DMEM溶液。在24孔培養板上做5組不同細胞因子組合的培養孔，以不加細胞因子的培養孔作為生長對照，每組重復三次，共培養6周。每周計數單個核細胞數和集落形成單位(CFU)。細胞因子分組為:(1)SCF+IL－3+IL－6;(2)SCF+IL－3+G－CSF;(3)SCF+IL－6+G－CSF;(4)SCF+IL－3+IL－6+G－CSF;(5)SCF+IL－3+IL－6+G－CSF+EPO。其中濃度分別為:SCF 100 ng/mL、IL－3 10 ng/mL、IL－6 50 ng/mL、G－CSF 80 ng/mL、EPO 2U。

1.3 數據分析:用SPSS 13.0軟件對數據進行統計學分析，對數據進行卡方檢驗。劑量資料采用平均數標準差表示。P＜0.05表明差異具有統計學意義。

2 結果

經流式細胞儀檢測，在分離后的細胞中CD34+造血干細胞占(81.31±4.57)%。在體外進行的細胞培養，其增殖能力有明顯差別。本研究中使用細胞因子的細胞培養孔的單個核細胞數明顯大于無細胞因子的細胞培養孔(P＜0.05)。此外，不同的細胞因子組合對擴增細胞的總數也有顯著的影響和差異，其中以第5種組合5種細胞因子聯合培養組單個核細胞增殖倍數最高，集落形成單位(CFU)形成率最高(P＜0.05)。結果顯示人臍血CD34+造血干細胞體外培養第13 d時達到高峰。

3 討論

臍帶血，指的是胎兒娩出、臍帶結扎并離斷后，殘留在臍帶內以及胎盤近胎兒側血管內的血液，其中含有大量干細胞，包括造血干細胞和間充質干細胞等。干細胞具有較強的自我復制能力。胚胎干細胞在一定的環境條件下可以分化為多能干細胞。造血干細胞是多能干細胞的一種，是骨髓中的干細胞，它具有自我更新的能力，也能夠分化成為各種血細胞前體細胞并最終分化為各種血細胞，如紅細胞、白細胞和血小板。臍帶血可以重建骨髓造血和人體免疫，多用來治療骨髓衰竭以及嚴重的血液疾病，在一些遺傳病和嚴重的免疫缺陷疾病中也被廣泛應用，并且獲得了一定的成功。有研究表明臍帶血中含有大量的干細胞，無論是對外界刺激的反應還是增值能力都比骨髓干細胞強。在體外生長培養中也顯示出由于骨髓干細胞的特點，比骨髓干細胞生長的更好，即更適合做體外擴增培養［1］。臍帶血不僅含有豐富的干細胞，其分泌生長因子的能力也很強。此外，其端粒酶活性也遠遠高于骨髓和外周血干細胞，這些特點導致了臍帶干細胞擴增會有更強的分裂存活能力。

造血生長因子分為刺激增殖的刺激因子和維持細胞存活的存活因子。根據各種生長因子的不同功能，合理搭配可以起到協同作用。本研究結果表明SCF、IL－3、IL－6、GCSF、EPO5種細胞因子聯合應用誘導CD34+造血干細胞體外擴增培養效果最好，且CD34+造血干細胞體外培養第13 d時達到高峰。目前，臍帶血造血干細胞的研究有不少成果，但至今成功移植的例子卻很有限。一方面是因為干細胞的數量較少;另一方面則是由于臍帶干細胞移植入成人骨髓的成功率較低［2］。所以，如何提高臍帶血造血干細胞的移植成功率，如何在體外擴增和培養臍帶血造血干細胞就成為了研究的熱點，也是其進一步發揮于臨床醫學應用所要面對的重要挑戰。

［1］ 劉琰，華鋅，卯國強.人臍帶血細胞體外擴增的實驗研究和意義［J］.中華器官移植雜志，2001，22:336－338.

［2］ 羅偉瓊，陳慧珍，黃春柳，等.臍血采集方法、影響因素分析及注意事項［J］.臨床和實驗醫學雜志，2010，6(1):63 －64.