微山湖河蟹養(yǎng)殖水域可培養(yǎng)好氧異養(yǎng)細(xì)菌多樣性調(diào)查

楊 軍， 毛慧文， 王玉芹， 孟榮江， 李羅英， 周 晶

(曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 山東 曲阜 273165)

微山湖是南四湖的別稱，由微山、邵陽、南陽、獨山四個彼此相連的湖泊組成，即廣義的微山湖，承接蘇、魯、豫、皖4省的來水，南北全長230 km，寬6.8～27.6 km，流域面積31 700 km2，主體屬山東省濟寧市，是中國第六大淡水湖，也是中國北方最大的淡水湖.該湖物產(chǎn)豐富，水資源門類齊全，內(nèi)有豐富的礦產(chǎn)資源，是中國重點煤炭基地之一，也是國內(nèi)著名風(fēng)景旅游區(qū)之一.異養(yǎng)細(xì)菌是水生態(tài)系統(tǒng)的分解者和小型濾食性動物的餌料，在湖泊生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中具有重要的作用[1-3].同時，水體的生態(tài)狀況不同，細(xì)菌群落的組成也有差異，且現(xiàn)在有關(guān)微山湖的研究報道較少，因而，本文研究了異養(yǎng)細(xì)菌群落組成的差異，對微山湖河蟹養(yǎng)殖水域細(xì)菌群落的時空分布進(jìn)行分析，以期為微山湖的水環(huán)境保護、漁業(yè)資源可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù).

1 實驗材料和方法

1.1 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基，LB富集固體培養(yǎng)基.

1.2 水樣、泥樣采集

于2010年11月5日，微山湖河蟹養(yǎng)殖區(qū)(北緯34°35′45″，東經(jīng)117°16′20″)，水樣在水面下30 cm處采集，表層泥樣用日產(chǎn)Ekman Birge采泥器采集.

1.3 微山湖中可培養(yǎng)異氧細(xì)菌的的計數(shù)和鑒定

1)采用10倍稀釋法對水樣梯度進(jìn)行稀釋；取各梯度稀釋液分別涂布在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行富集培養(yǎng)；25℃培養(yǎng)至形成菌落.

2)密集觀察菌落形態(tài)[4-9]，并進(jìn)行群落統(tǒng)計，即根據(jù)菌落的表面形狀、隆起狀況、邊緣形狀、色澤、透明感來判斷菌落類型，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、革蘭氏染色及接觸酶和氧化酶反應(yīng)特性進(jìn)行生物多樣性的分析.

3)選擇具有獨特形態(tài)的優(yōu)勢菌落，純化后進(jìn)行生理生化試驗，按《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，并參照Bergey氏細(xì)菌鑒定手冊進(jìn)行鑒定.

1.4 群落多樣性分析

群落多樣性用豐度(S) 、優(yōu)勢度(P)、Simpson指數(shù)(L)和Shannon-Wiener指數(shù)(H)來表示.具體計算方式如下.

S：用樣品中所含的不同形態(tài)特征的菌落種類數(shù)來表示.P：用某一類型的菌落數(shù)所占的比例來表示，即Pi=ni/N.L：指樣品中隨機得到的兩個分離物為同一類型菌落的概率.L越小，表示種群越豐富，種群分布越均勻.

H是反映群落多樣性與均勻度的復(fù)合參數(shù).H越大，表示生物多樣性越高.

其中S為樣本中不同類型的菌落數(shù)量，ni為樣本中某一特定類型菌落的數(shù)量，pi為某一特定類型的菌落數(shù)量占總菌落數(shù)的比例，N為樣本的菌落總數(shù)[8].

2 結(jié)果與分析

2.1 微山湖河蟹養(yǎng)殖水域中可培養(yǎng)異氧細(xì)菌的計數(shù)

于2010年11月5日，對微山湖河蟹養(yǎng)殖區(qū)(北緯34°35′45″，東經(jīng)117°16′20″)水體和表層底泥中可培養(yǎng)異養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了分離,發(fā)現(xiàn)作為富營養(yǎng)化湖泊的微山湖,水體中可培養(yǎng)異養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量很多，全湖平均值有1.70×104cfu /mL，一般認(rèn)為自然水體中細(xì)菌總數(shù)100～1000cfu/mL為清潔水，大于105cfu/mL則為極不清潔水，這說明微山湖河蟹養(yǎng)殖區(qū)水質(zhì)污染嚴(yán)重：有機污染物處于較高的水平，這就導(dǎo)致有機營養(yǎng)型的異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量很多.這與近年對其湖水有機物超標(biāo)率達(dá)60%以上，湖水富營養(yǎng)化程度嚴(yán)重的研究結(jié)果相似.另外，采樣期間氣溫較低，細(xì)菌的繁殖速度降低，而可培養(yǎng)異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量卻不低，這就更加反映了其富營養(yǎng)化程度的嚴(yán)重性；另一方面也可能是由于氣溫較低，不利于藻類和原生動物的繁殖，而微山湖又是許多鳥遷徙必經(jīng)的中轉(zhuǎn)站，據(jù)調(diào)查，僅9-10月南北往來或中途在此居留覓食的旅游鳥就有96種，綜合各因素，導(dǎo)致采樣期間養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)藻類和原生動物的生物量不十分豐富，使水體中異養(yǎng)細(xì)菌可利用的可溶性有機碳含量較高.

表層底泥中可培養(yǎng)異樣細(xì)菌的數(shù)量平均為1.2×105cfu/g(以干泥計，下同)，從采樣時間看，氣溫較低，細(xì)菌的繁殖速度也會隨之降低，但此季節(jié)底泥中微生物的生物量仍相對較高，這更加說明底泥中有機污染程度嚴(yán)重，當(dāng)然也可能是由于底棲原生動物不活躍的原因造成的.

2.2 菌落形態(tài)觀察和群落統(tǒng)計

微山湖水體中的可培養(yǎng)異養(yǎng)細(xì)菌的菌落類型很少，在從河蟹養(yǎng)殖區(qū)水體和表層底泥中分離到的25株菌的初步鑒定過程中，我們得到的結(jié)果是：2，11，19，20這4株菌屬于氣單胞菌屬(Aeromonas)，4屬假單胞菌屬(Pseudomonas)；1，3，6，8，13，14，15，17，23這9株菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)；8屬于硝化桿菌屬(Nitrobacter)；5，9，12屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)；10，16，18，21，22，24，25屬于鏈球菌屬(Streptococcus).

2.3 微山湖河蟹養(yǎng)殖水域可培養(yǎng)異養(yǎng)細(xì)菌的群落多樣性

對微山湖河蟹養(yǎng)殖水域可培養(yǎng)異養(yǎng)細(xì)菌的生態(tài)調(diào)查見表1、2.表中結(jié)果顯示，水體中存在的主要是革蘭氏陽性菌 (占93%左右)，以芽孢菌屬、鏈球菌屬和氣單胞菌屬占優(yōu)勢，革蘭氏陰性菌較少，球形菌較少，且沒有產(chǎn)色素的菌.芽孢桿菌的比例相對較高，平均43.75%,這可能與季節(jié)轉(zhuǎn)換期溫度變化較大，對環(huán)境適應(yīng)能力強的芽孢菌能較多地存活下來有關(guān).

另外，我們還看到，底泥中存在的主要是革氏陰性菌(占62.5%)，以鏈球菌屬占優(yōu)勢(占62.5%)，多桿狀或棒狀菌，產(chǎn)色素菌相對較高，占44.4%.底泥中只含有3種類型的菌落，說明濟寧微山湖中異養(yǎng)細(xì)菌的種群不豐富，物種多樣性較差.

調(diào)查還發(fā)現(xiàn)微山湖河蟹養(yǎng)殖水域優(yōu)勢菌的優(yōu)勢度高, 多樣性指數(shù)低(表3).水體中優(yōu)勢菌的優(yōu)勢度為43.75%，多樣性指數(shù)H為1.542.底泥中優(yōu)勢菌的優(yōu)勢度為55.56%, 多樣性指數(shù)H為0.994 9.微山湖河蟹養(yǎng)殖水域異養(yǎng)細(xì)菌分布的特點是以有芽孢的革蘭氏陽性桿菌占絕對優(yōu)勢(93%左右)，革蘭氏陰性菌很少，多為氣單胞菌屬或鏈球菌屬，這與我國其他淡水湖泊細(xì)菌群落有所不同，這可能是由當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖區(qū)的特殊環(huán)境造成的.

總之，對微山湖河蟹養(yǎng)殖水域中細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的研究有助于對其水環(huán)境的綜合評價及治理提供參考，也為對微山湖微生物資源的進(jìn)一步了解和開發(fā)打下了基礎(chǔ).

3 討論

3.1 水溫對水域異養(yǎng)細(xì)菌分布的影響

溫度是影響生物酶活性的重要因子，從季節(jié)變化看，水溫增加對細(xì)菌增殖具有一定的促進(jìn)作用，這與其它很多研究者調(diào)查結(jié)果一致[10]，在此次調(diào)查期間內(nèi)，11月份為初冬季節(jié)，水溫較低，水環(huán)境中的很多營養(yǎng)物質(zhì)比較難以利用，再加上水產(chǎn)動物和植物較少，這也許是影響此次水域異養(yǎng)細(xì)菌多樣性分布的主要原因.

3.2 河蟹養(yǎng)殖對水域異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的影響

研究報道魚類養(yǎng)殖產(chǎn)生的殘餌、糞便及殘骸等可造成底泥有機質(zhì)富集，與之相比，本研究水域有機質(zhì)分布便呈現(xiàn)較高的分布特點.有機質(zhì)含量的高低形成了與之相應(yīng)的異養(yǎng)細(xì)菌豐度，與已有研究報道的有機質(zhì)可刺激細(xì)菌生長[11]的結(jié)果一致.

3.3 河蟹養(yǎng)殖對水域異養(yǎng)細(xì)菌多樣性的影響

已有研究顯示，養(yǎng)魚場和對照點底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在較大差異，養(yǎng)魚場底泥革蘭氏陰性菌比對照點革蘭氏陰性菌所占比例高，對照點革蘭氏陽性菌往往占多數(shù).如 Chelossi 等[12]研究發(fā)現(xiàn)沿海養(yǎng)魚場沉積物中有超過30%的革蘭氏陰性菌，對照點( 距養(yǎng)殖場200 m)革蘭氏陰性菌很少，革蘭氏陽菌占81%.Vezzulli等[11]對西地中海海區(qū)一養(yǎng)魚場沉積物微生物群落的研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖區(qū)沉積物中異養(yǎng)細(xì)菌CBF(Cytophaga/Flexibacter-likebacteria)占優(yōu)勢，且存在弧菌等病原菌，而對照點(距養(yǎng)殖場200 m)革蘭氏陽性菌數(shù)量達(dá)到總菌數(shù)的90%.本研究結(jié)果顯示，微山湖河蟹養(yǎng)殖水體中優(yōu)勢菌的優(yōu)勢度為43.75%，多樣性指數(shù)H為1.542.底泥中優(yōu)勢菌的優(yōu)勢度為55.56%，多樣性指數(shù)H為0.9949.微山湖河蟹養(yǎng)殖水域異養(yǎng)細(xì)菌分布的特點是以有芽孢的革蘭氏陽性桿菌占絕對優(yōu)勢(93%左右)，革蘭氏陰性菌很少，多為氣單胞菌屬或鏈球菌屬，研究證明了污染物的長期排放將降低自然生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性，該結(jié)果也在本研究中得到了佐證.

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