蘇木對甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌抗菌活性研究及其活性成分分離＊

蒲 榮，郭永燦，區敬華，劉紅志，譚光羨（.東莞市寮步醫院檢驗科，廣東東莞 5400；.重慶醫科大學臨床檢驗診斷學省部共建教育部重點實驗室，重慶 40006；.中山大學藥學院藥理教研室，廣東廣州 50080）

甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）是院內感染主要病原體，具有多藥耐藥性，分離率高，治療困難，致死率高，部分地區感染率高達90%，且耐藥基因呈多樣性［1－3］。西藥抗菌藥物易誘導細菌耐藥且毒性較大，中藥不易誘導耐藥菌的產生，且不良反應較弱。因此，從中藥中尋找抗MRSA中草藥成為研究焦點。蘇木是中國傳統中藥，為豆科云實屬植物的干燥心材，有抗菌消炎、行血祛瘀、免疫抑制等功效［4］。因此，本文研究了蘇木抗MRSA活性及其活性成分，以期為研發新型抗MRSA藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 本院檢驗科微生物室保存的MRSA菌株。甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）標準菌株ATCC29213由廣東省臨床檢驗中心提供；已鑒別證實的蘇木購自東莞市藥材公司，產地為中國云南；NIH小鼠由中山大學實驗動物中心提供；三氯甲烷、甲醇購自天津市百世化工有限公司；M－H瓊脂培養基、M－H牛肉湯購自廣東環凱微生物試劑公司；柱層析硅膠和薄層層析硅膠均為青島海洋化工廠產品；葡聚糖凝膠Sephadex LH－20為GE Healthcare Bio－Sciences AB公司產品，溶劑均為分析純。

1.2 儀器 桂林廣陸有限公司精度0.01mm游標卡尺，Waters Alliance 2690高效液相色譜儀，996二極管陣列檢測器，Waters 2010色譜工作站。

1.3 方法 （1）按抽溶劑不同分成3組，即甲醇組、氯仿組、水組。稱取蘇木心木8 000g，碾成粉末，過20目篩，備用。各取300g蘇木心粉溶于1 000mL甲醇和1 000mL氯仿，室溫浸泡72h，過濾，濃縮，減壓干燥，稱重。取300g蘇木心粉加入3 000mL水中，煮沸60min，過濾，減壓干燥，稱重。將3組提取物用二甲基亞砜（DMSO）配制濃度8mg／mL的藥液備用。因本實驗各步驟均以前一步驟為基礎，故具體操作方法在結果中描述。

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行數據分析；數據多組間比較采用方差分析；顯著性檢驗水準為α＝0.05。

2 結 果

2.1 蘇木不同提取液MIC值 制備濃度為107CFU／mL菌液；將各組蘇木8mg／mL的提取物藥液10mL倍比稀釋，溶于90mL M－H肉湯中，傾注平板，形成800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、0μg／mL共10個濃度梯度；接種細菌，35℃培養18～24h后判讀MIC值，比較不同提取液對MRSA及MSSA的MIC值。結果顯示蘇木甲醇提液抗MRSA能力最強，MIC為200μg／mL，對 MSSA的 MIC為400μg／mL（P＜0.05），蘇木水提取液次之。見表1。

表1 蘇木不同組別提取液抗MRSA的MIC值（μg／mL）

2.2 蘇木分離組分抑菌圈與MIC值 參照趙煥新等［5－6］的方法分離蘇木組分，取蘇木甲醇提取液，采用乙酸乙酯萃取、硅膠柱色譜、Sephadex LH－20柱色譜、ODS柱色譜等方法分離組分，將各組分用DMSO配制濃度200μg／mL的藥液，點種于M－H平板，篩選抑菌圈并倍比稀釋測定MIC值。共分離獲得16種組分；抑菌圈直徑為14.85、12.95、12.70mm和小于12.50mm；組分最小MIC值為12.50μg／mL，與其他組分比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 蘇木分離組分抑菌圈直徑與MIC值

2.3 最佳抗MRSA組分鑒定 收集MIC為12.5μg／mL組分，參照趙煥新等［5－6］的方法鑒定，同時取該組分和巴西蘇木素對照品2μL，點樣硅膠GF254薄層板上，三氯甲烷、丙酮、甲酸（8∶4∶1）展開，取出，晾干，紫外光燈254nm下檢視。結果顯示該組分呈淺黃色結晶，10%H2SO4顯棕紅色，色譜位置與巴西蘇木素一致，顯相同的顏色斑點，電噴霧質譜相對分子質量為286，結合氫譜和碳譜信號及Namikoshi等［7］的文獻數據資料，確定該組分為巴西蘇木素。

2.4 安全性實驗 清潔級NIH小鼠40只，體質量18～22g，雌雄各半，觀察3d，未見活動、進食、糞便異常；隨機分成4組，每組10只，每籠5只，室溫23～28℃，濕度40%～70%條件下飼養；連續7d皮下注射12.5、25、50μg／mL巴西蘇木素和生理鹽水各0.2mL／d，連續14d觀察急性毒性反應和死亡情況等指標，結果顯示40只動物活動、正常、糞便均正常，無明顯不良反應，無小鼠死亡。

3 討 論

蘇木不同提取物對MRSA抗菌活性不同［8］。本研究證明蘇木的不同提取物抗菌能力差異較大，醇提取物的抗菌活性最強，對MRSA、MSSA的MIC分別為200、400μg／mL。和生琦等［9］應用生物傳感器跟蹤技術篩選證實黃藥子、五倍子、半枝蓮、山豆根、黃連、草果、核桃根等7種對MRSA有不同程度抑制作用的中草藥。

巴西蘇木素抗MRSA高效且無不良反應。本研究證明，巴西蘇木素對107CFU／mL菌液的抑菌圈直徑為14.85mm，MIC為12.50μ／mL，且對NIH小鼠無不良反應。巴西蘇木素為蘇木中最主要的化學成分，結構獨特，在天然產物中少見，藥理活性主要有免疫、鎮靜消炎及抗補體作用。Kim等［10］發現蘇木中的巴西蘇木素對MRSA、耐萬古霉素腸球菌（VRE）、具有多藥耐藥性的洋蔥伯克霍爾德菌及其他菌種具有很強的抑制作用，MIC為4～32μg／mL。

中藥抗MRSA具有較好的優勢。MRSA具有多藥耐藥性，耐藥基因也呈多樣性，如β－內酰胺酶類藥物耐藥基因mecA、氨基糖苷類藥物耐藥基因aac／aph、大環內酯類－林可霉素－鏈陽霉素B類耐藥基因ermA／ermB／ermC、四環素類藥物耐藥基因tetM、氟喹諾酮類耐藥基因norA及萬古霉素耐藥基因vanA等。中草藥不易誘導產生耐藥菌株，且不良反應小。本研究證實蘇木醇提取物具有較好的抗MRSA活性，其組分巴西蘇木素抗MRSA活性高且無不良反應，為探索新型抗MRSA藥物奠定了一定基礎。

［1］ Stone ND，Lewis DR，Lowery HK，et al.Importance of bacterial burden among methicillin－resistant Staphylococcus aureus carriers in a long－term care facility［J］.Infect Control Hosp Epidemiol，2008，29（2）：143－148.

［2］ Chen H，Liu Y，Jiang X，et al.Rapid change of methicillinresistant Staphylococcus aureus clones in a Chinese tertiary care hospital over a 15－year period［J］.Antimicrob A－gents Chemother，2010，54（5）：1842－1847.

［3］汪復，朱德妹，胡付品，等.2009年中國CHINET細菌耐藥性檢測［J］.中國感染與化療雜志，2010，10（5）：325－334.

［4］賴成虹，杜鵑，劉信東，等.蘇木醇提取物對實驗性自身免疫性重癥肌無力小鼠腓腸肌組織結構的影響［J］.中國神經免疫學和神經病學雜志，2011，17（6）：431－434.

［5］趙煥新，白虹，王元書，等.HPLC測定蘇木中的巴西蘇木素和原蘇木素B［J］.華西藥學雜志，2010，3（1）：16－18.

［6］趙煥新，白虹，王元書.蘇木酚類成分核磁共振波譜特征［D］.上海：中國科學院上海冶金研究所，2000.

［7］ Namikoshi M，Nakata H，Nagai M，et al.Homoisoflavonoids and related compounds.II.Isolation and absolute configurations of 3，4－dihydroxylated homoisoflavans and brazilins from Caesalpinia sappan［J］.Chem Pharm Bull，1987，35（7）：2761－2773.

［8］ Niranjan RVL，Ravikanth V，Jansi Lakshmi V，et al.In hibitory activity of homoisoflavonoids from Caesalpinia sappan against Beauveria bassiana［J］.Fitoterapia，2003，74（6）：600－602.

［9］和生琦，李軍，吳翀，等.以PBP2a為靶點應用生物傳感器技術篩選提取拮抗MRSA中藥［J］.解放軍藥學學報，2007，23（5）：353－356.

［10］Kim KJ，Yu HH，Jeong SI，et al.Inhibitory effects of Cae－salpinina sappan on growth and invasion of methicillin－resistant Staphylococcus aureus［J］.J Ethnopharmaeol，2004，91（1）：81－87.