柳氮磺胺吡啶中一個雜質的結構測定

姚旭波 沈莉 許愛紅

（上海中西三維藥業有限公司 上海 200331）

柳氮磺胺吡啶（sulfasalazine，1）作為一個使用歷史悠久的傳統藥，有抗炎和抗菌的雙重作用，口服后很少吸收，在腸壁中分解起治療作用，多用于潰瘍性結腸炎的治療[1-2]。近年的許多資料表明，它還能抑制免疫復合物及類風濕因子的合成，從而對類風濕關節炎的免疫病理損傷發生影響[3-5]。該藥用于治療炎性腸病及類風濕關節炎已有40多年的歷史。20世紀70年代后期的試驗證明，該藥可改善類風濕關節炎的臨床癥狀并能使C反應蛋白和血沉有不同程度下降[6-7]。

柳氮磺胺吡啶是由磺胺吡啶和水楊酸經重氮偶合反應而合成的（圖1）。

圖1 1的合成路線

基于自由基機理的重氮偶合反應復雜、副產物多，因此柳氮磺胺吡啶成品所含雜質比較多，且通過后期的精制方法很難去除。我們在對本公司生產的柳氮磺胺吡啶原料藥雜質進行研究時，發現其中一個未知雜質的含量在0.06%～0.08%之間。根據人用藥物注冊技術要求國際協調會議（ICH）技術指導原則的要求，對于柳氮磺胺吡啶這個日服用量超過6 g、未知雜質超過0.05%的藥品必須確認結構。所以，我們分離提純了這個雜質（2），并確定其結構。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

AV500型核磁共振儀和micrOTOF II質譜儀（瑞士Bruker公司）；Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。

1.2 試劑

1（上海中西三維藥業有限公司，批號201204045，純度97.7%）；薄層色譜硅膠H（青島海洋化工廠出品）；甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純，水為超純水。

2 有關物質的分離與制備

2.1 色譜條件

按照歐洲藥典EP7.7標準中的有關物質分析方法分析。色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠（5 μm）為固定相的不銹鋼柱，柱長25 cm×4.6 mm。檢測波長320 nm，流速1.0 ml/min，柱溫25 ℃，進樣量20 μl。流動相A：pH 4.8的磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鈉1.13 g和醋酸鈉2.5 g，加水900 ml，用冰醋酸調pH至4.8，并用水稀釋至1 000 ml）；流動相B：流動相A-甲醇(10：40，v/v)的混合液。洗脫條件見表1。

表1 柳氮磺胺吡啶有關物質液相色譜流動相洗脫條件

2.2 方法與結果

取1適量，用稀氨溶液（氨水7.8 ml，加水稀釋至1 000 ml）配制濃度為1 mg/ml的供試品溶液，進樣量20 μl，記錄色譜圖。在上述色譜條件下，1主峰保留時間為23.070 min，雜質2的保留時間為15.862 min（圖2）。

2.3 2的分離制備

取我公司柳氮磺胺吡啶的精制母液，溶劑經旋轉蒸發濃縮至褐色黏稠液。取5 g溶于100 ml氯仿-丙酮-甲酸（60：20：2）的混合液中，再加入10 g薄層色譜硅膠H粉，混勻，置旋轉蒸發儀上蒸除混合溶劑，得吸附了樣品的混合硅膠H濕粉。將此濕粉放入鼓風烘箱內烘干，得吸附了樣品的棕黃色混合硅膠H干粉，重約13 g。將此混合硅膠H干粉加入已裝有薄層色譜硅膠H的色譜柱（5 cm×60 cm）中，用氯仿-丙酮-甲酸（60：20：2）洗脫（必要時可增加甲酸的比例），并用硅膠薄層色譜（以氯仿-丙酮-甲酸=60：30：5為展開劑，在紫外光254 nm下檢視）跟蹤檢測洗脫液，收集Rf值約為0.45的洗脫液，將其中的溶劑蒸發除盡，得棕色油狀物2的粗品。該粗品中尚混有殘余的柳氮磺胺吡啶（Rf值約為0.7），需按上述方法經過反復幾次柱層析，才能去除柳氮磺胺吡啶。最后得到淺黃色粉末狀固體2，HPLC含量為99.3%。

圖2 柳氮磺胺吡啶的有關物質色譜圖

3 雜質2的結構解析

2在ESI質譜條件下的質譜主峰為m/z 482.096 2[M+H]+，與推測的分子式為C22H19N5O4S2的分子量481.087 8相符，可以確定2的分子式為C22H19N5O4S2。

從核磁共振氫譜和碳譜可以看出該結構是完全對稱的結構（表2），存在兩個對位取代的苯環和兩個類似于吡啶環的結構。

表2 2的1H NMR、13C NMR和2D相關譜數據

在1H-1H COSY實驗中，δH7.74和δH7.18相關，這8個氫可以確定為兩個對位取代苯環上的氫；δH8.03與δH6.85相關，δH6.85同時又與δH7.66相關，δH7.66同時和δH7.09相關，根據化學位移和耦合常數規律，可以確定δH8.03為芳香環上N鄰位的氫，即為H-6,6’，δH6.85 歸屬為 H-5,5’，δH7.66 歸屬為 H-4,4’，δH7.09 歸屬為 H-3,3’。

HSQC實驗中，δH9.16和δH11.60的氫沒有對應的相關碳的信號，可以確定為活潑氫的信號。δH9.16歸屬為H-14, δH11.60歸屬為H-13,13’，譜圖中δH11.60的峰積分值偏小，是因為這個峰比較寬導致積分值不準確。

NOESY實驗中δH9.16和δH7.18相關，可以確定δH7.18 為 H-9,9’,11,11’的信號 , 而 δH7.74 就可以確定為H-8,8’,12,12’的信號。

HSQC實驗中，δH7.74與δC128.47相關，δC128.47歸屬為 C-8,8’,12,12’； δH7.18 與 δC116.27 相關，δC116.27 歸屬為 C-9,9’,11,11’； δH8.03 與 δC144.74 相關，δC144.74 歸屬為 C-6,6’； δH6.85 與 δC115.88 相關，δC115.88歸屬為C-5,5’；δH7.66與δC139.36相關，δC139.36歸屬為 C-4,4’；δH7.09與 δC113.06相關，δC113.06 歸屬為 C-3,3’。

HMBC 實驗中，δH7.66和 δH8.03與 δC153.14相關，δC153.14歸屬為 C-2,2’；δH7.74與δC145.33相關，δC145.33歸屬為 C-10,10’；δH7.18與 δC132.75相關，δC132.75 歸屬為 C-7,7’。

綜合以上信息，將2的結構解析為雙{4-[(2-亞氨基吡啶-1(2H)-基)磺酰]苯基}胺（圖3）。

致謝

本文中的質譜委托復旦大學檢測，核磁共振譜委托上海醫藥集團中央研究院檢測，結構解析得到了上海睿智化學研究公司的幫助，特此鳴謝。

圖3 2的化學結構

[1] Sircar JC, Schwender CF, Carethers ME. Inhibition of soybean lipoxygenase by sulfasalazine and 5-aminosalicylic acid: a possible mode of action in ulcerative colitis[J].Biochem Pharmacol, 1983, 32(1): 170-172.

[2] 濮永杰, 柳汝明, 唐堯. 奧沙拉嗪與柳氮磺吡啶治療潰瘍性結腸炎療效與安全性的系統評價[J]. 中國藥房, 2010,21(20): 1899-1902.

[3] Neumann VC, Grindulis KA. Sulfasalazine in rheumatoid arthritis: an old drug revived[J]. J R Soc Med, 1984, 77(3):169-172.

[4] Pullar T. Sulfasalazine and related drugs in rheumatoid arthritis [J]. Pharmacol Ther, 1989, 42(3): 459-468.

[5] Weinblatt ME, Reda D, Henderson W,et al. Sulfasalazine treatment for rheumatoid arthritis: a metaanalysis of 15 randomized trials [J]. J Rheumatol, 1999, 26(10): 2123-2130.

[6] 王鳴軍, 陳志偉, 沈月平, 等. 來氟米特與柳氮磺吡啶治療強直性脊柱炎療效觀察[J]. 蘇州大學學報（醫學版）,2008, 28(2): 277-279.

[7] Chen J, Liu C. Is sulfasalazine effective in ankylosing spondylitis? A systematic review of randomized controlled trials[J]. J Rheumatol, 2006, 33(4): 722-731.