家蠅幼蟲消化器官中纖維素酶的組成及酶活性分析

張 姝，胡 蓉，吳建偉，國(guó) 果，付 萍

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550004)

纖維素酶是水解纖維素及其衍生物生成葡萄糖的三種酶的組合酶系，包括內(nèi)切β－1，4－葡聚糖酶 (endo－β－1，4 glucanase，EC 3.2.1.4，EG)，外切β－1，4－葡聚糖酶 (exo－β－1，4－glucanase，EC3.2.1.91，CBH)和β－葡萄糖苷酶(β－glucosidase，EC 3.2.1.21，BG)，這三種酶各有專一性又能相互協(xié)調(diào)，通常只有在這三種酶的協(xié)同作用下，才能把纖維素分子降解為葡萄糖(Duan and Feng，2010;Clarke，1997)。目前已有研究表明天牛 (殷幼平等，2000;Wei YD，et al.，2006;索風(fēng)梅等，2007)和白蟻 (曾文慧等，2011;Nathan， etal.， 2011;Tokuda， etal.，2012)等昆蟲的消化器官內(nèi)均有完整的纖維素酶系，并以此獲得生存所需的能量。家蠅 Musca domestica是一種分布廣泛、數(shù)量眾多的雙翅目昆蟲，人工養(yǎng)殖的家蠅幼蟲通常在富含纖維素的麥麩中進(jìn)行喂養(yǎng)，家蠅的消化器官內(nèi)是否也含有纖維素酶引起我們的關(guān)注。本研究通過DNSA法(Miller，1959)，以濾紙為底物檢測(cè)家蠅各消化器官是否具有纖維素酶活性，并通過纖維素酶復(fù)合酶系3種酶的特異性底物檢測(cè)家蠅纖維素酶的組成，同時(shí)初步探討溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)家蠅纖維素酶活性的影響，為今后纖維素酶的來源增加新的家族和類型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)昆蟲

家蠅由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲教研室保存。養(yǎng)蠅房恒溫25℃，光周期12L∶12D，成蟲以水、奶粉和白糖喂食，幼蟲以麥麩和水為食料。

1.1.2 主要試劑

水楊苷、羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素(Sigma)，定性濾紙 (杭州特種紙業(yè)有限公司)，3，5－二硝基水楊酸 (DNSA，Genview)，SK3071非干擾型蛋白濃度檢測(cè)試劑盒 (上海生工生物工程有限公司)。

1.1.3 主要儀器

SZ61立體顯微鏡 (OLYMPUS)，CT15RE高速冷凍離心機(jī) (HITACHI)，超低溫電冰箱(Thermo scientific)，752N紫外分光光度計(jì) (上海精密科學(xué)儀器有限公司)，電子天平 (北京賽多利斯系統(tǒng)儀器有限公司)，超純水器 (艾柯公司)，移液器 (Eppendorf)。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備

新鮮3齡家蠅幼蟲洗凈體表上的飼料殘?jiān)笥贸兯?～3 h，使其吐凈體內(nèi)污物，用75%乙醇對(duì)家蠅3齡幼蟲表面消毒30 min，超純水清洗2次，濾紙吸干體表水分，20℃預(yù)凍10 min，解剖顯微鏡下分離家蠅3齡幼蟲的唾液腺、前腸、中腸、后腸。按0.15 g組織加入1 mL 0.1M醋酸－醋酸鈉緩沖液 (pH=5.6)，冰浴研磨，在12000 rpm，4℃，離心10 min，取上清液即為纖維素酶的粗酶液，置于－80℃冰箱中待用。

1.2.2 粗酶液蛋白定量

采用BCA蛋白濃度測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定(Smith et al.，1985)。取10 μL家蠅粗酶液和6種不同濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液加入2 mL的BCA工作液，在480 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收值，計(jì)算出粗酶液的蛋白濃度。

1.2.3 濾紙酶活性測(cè)定

采用DNSA法測(cè)定，每個(gè)離心管中放入10 mg定量濾紙片，再加入0.3 mL 0.1 M醋酸－醋酸鈉緩沖液 (pH5.6)將其浸潤(rùn)。加入粗酶液0.1 mL混勻后在50℃水浴條件下反應(yīng)60 min，立即加入0.3 mL DNSA顯色劑終止反應(yīng)，在沸水浴顯色5 min，冷卻至室溫后，用0.1M醋酸－醋酸鈉緩沖液定容至5 mL。設(shè)陰性對(duì)照 (以緩沖液代替粗酶液)。于紫外分光光度計(jì)測(cè)OD540值，每一個(gè)樣品3個(gè)生物重復(fù)，每組做3個(gè)重復(fù)。從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡萄糖含量。在 pH=5.6、50℃反應(yīng)60 min的條件下，以每分鐘產(chǎn)生1 umoL葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活性單位 (IU)。纖維素酶活性大小用比活力 (Willis et al.，2010)，即每mg蛋白中的酶單位數(shù)量來表示。纖維素酶比活力(IU/mg)=(m×5.56)/(V×C×t)。m:產(chǎn)生的葡萄糖含量 (mg);C:粗酶液蛋白濃度(mg/mL);V:反應(yīng)液中加入的粗酶液體積(mL);t:反應(yīng)時(shí)間 (min)。

1.2.4 β－葡萄糖苷酶、內(nèi)切β－1，4－葡聚糖酶、外切β－1，4－葡聚糖酶活力的測(cè)定

采用DNSA法測(cè)定，在離心管中分別加入1%水楊苷、1%羧甲基纖維素鈉、1%微晶纖維素0.3 mL后加入粗酶液0.1 mL，混勻后在50℃水浴條件下反應(yīng)60 min，立即加入0.3 mL DNSA顯色劑終止反應(yīng)，在沸水浴顯色5 min，冷卻至室溫后，用0.1M醋酸－醋酸鈉緩沖液定容至5 mL。設(shè)陰性對(duì)照 (以緩沖液代替粗酶液)。于紫外分光光度計(jì)測(cè)OD540值，每一個(gè)樣品3個(gè)生物重復(fù)，每組做3個(gè)重復(fù)。計(jì)算方法同1.2.3。

1.2.5 纖維素酶特性初步研究

1.2.5.1 最適反應(yīng)時(shí)間的測(cè)定取0.1 mL粗酶液分別與0.3 mL的1%羧甲基纖維素鈉、1%水楊苷和1%微晶纖維素充分混合，分別溫浴10 min，20 min，40 min，60 min，80 min，100 min，120 min后，按1.2.5所述方法分別測(cè)定EG、BG和CBH的酶活性，確定最適反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5.2 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的測(cè)定

取0.1 mL粗酶液分別與0.3 mL的1%羧甲基纖維素鈉、1%水楊素和1%微晶纖維素充分混合，分別在 20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃溫度下水浴，按1.2.5所述方法分別測(cè)定EG、BG、CBH的酶活性，以溫度為為橫坐標(biāo)，纖維素酶活力為縱坐標(biāo)建立反應(yīng)影響曲線。熱穩(wěn)定性測(cè)定的方法 (Teng et al.，2010;Liu et al.，2011)。將粗酶液在 20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃和80℃溫浴1 h后，分別與不同底物在50℃、pH5.6條件下反應(yīng)1 h，檢測(cè)3種酶的活性。以最適溫度和最適反應(yīng)時(shí)間條件下粗酶液的酶活性(設(shè)為T0)為對(duì)照。

1.2.5.3 家蠅纖維素酶的混合底物實(shí)驗(yàn)將粗酶液與纖維素酶3種底物 (1%羧甲基纖維素鈉、1%水楊素和1%微晶纖維素)混勻后，按1.2.5所述方法測(cè)定在相同條件下EG、BG和CBH的綜合作用。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同組織樣本中各種纖維素酶活性皆用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，并用單因素方差分析檢驗(yàn)，組間比較用q檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠅粗酶液蛋白濃度測(cè)定

根據(jù)蛋白定量試劑盒說明書，讀取不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA吸光度值，繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各待測(cè)粗酶液蛋白濃度 (圖1，表1)。

圖1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Protein standard curve

表1 家蠅3齡幼蟲不同組織粗酶液蛋白含量 (mg/mL)Table 1 The protein content in different organizations from Musca domestica larvae(mg/mL)

2.2 濾紙酶活性測(cè)定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。吸光度 (x)與葡萄糖濃度 (y)之間呈良好的線性關(guān)系。通過FPA濾紙酶活性 (filter paper activity，F(xiàn)PA)檢測(cè)，家蠅3齡幼蟲唾液腺、前腸、中腸、后腸粗酶液均具有降解濾紙產(chǎn)生葡萄糖的能力，濾紙酶活性見圖3。如圖3所示，家蠅3齡幼蟲消化器官皆具有濾紙酶活性，在消化器官中，中腸的濾紙酶活性最高，其次是唾液腺，前腸和后腸較低。

2.3 β-葡萄糖苷酶、內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶、外切β-1，4-葡聚糖酶活性的測(cè)定

通過DNSA顯色法檢測(cè)到家蠅3齡幼蟲唾液腺、前腸、中腸、后腸粗酶液均具有纖維素復(fù)合酶系中的3種酶，即CBH、EG和BG。這3種酶在不同消化器官中的配比關(guān)系和活性表現(xiàn)存在一定的差異。在相同的條件下，3種纖維素酶中，CBH在家蠅3齡幼蟲各組織中酶活性都是最高的，EG除了在前腸和后腸的酶活性比列比BG的略高以外，其它組織中BG酶活性較EG的高。(圖4，表2)。

圖4 家蠅3齡幼蟲不同組織纖維素酶活性Fig.4 Distribution of three enzymes in digestive organs from Musca domestica larvae

表2 家蠅3齡幼蟲各組織3種纖維素酶活性所占比例 (%)Table 2 Proportion of activity of three enzymes in digestive organs from Musca domestica larvae

2.4 家蠅消化道內(nèi)纖維素酶特性初步研究

2.4.1 最適反應(yīng)時(shí)間的測(cè)定

在不同反應(yīng)時(shí)間下測(cè)定EG、CBH和BG的酶活性，結(jié)果如圖5所示.粗酶液與底物反應(yīng)10 min至60 min后，3種纖維素酶隨反應(yīng)時(shí)間的增加，其酶活性也逐漸增強(qiáng)，在60 min時(shí)活性到達(dá)最高。而后隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)酶活性逐漸降低。據(jù)此確定家蠅纖維素酶活最適反應(yīng)時(shí)間為60 min。

圖5 不同反應(yīng)時(shí)間下3種纖維素酶的活性Fig.5 Activities of the cellulases at different time

2.4.2 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的測(cè)定

圖6 不同反應(yīng)溫度下3種纖維素酶的活性Fig.6 Activities of the cellulases at different temperature

如圖6所示，家蠅EG酶活性從20℃開始上升，到50℃時(shí)酶活性最高;BG在40至60℃時(shí)酶活較高，50℃時(shí)酶活性最高;CBH的酶活性在40℃至70℃酶的活性較高，在50℃時(shí)達(dá)到最高.因此確定3種酶最適反應(yīng)溫度為50℃。家蠅纖維素酶對(duì)溫度的穩(wěn)定性研究中發(fā)現(xiàn)，家蠅消化道內(nèi)的BG、EG和CBH具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，在較低溫度時(shí) (20℃，30℃，40℃)僅降低 6.10% ～21.11%的活性，60℃是家蠅消化道內(nèi)纖維素酶活性熱穩(wěn)定性變化的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，再此溫度處理下酶活性下降了50.1% ～64.98%，在80℃以上基本完全失活 (表3)。

表3 家蠅3種纖維素酶的熱穩(wěn)定性Table 3 Stability of three enzymes from Musca domestica at different temperature

2.4.3 家蠅纖維素酶的混合底物實(shí)驗(yàn)

粗酶液與3種特異性底物混合進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，測(cè)定家蠅纖維素酶體內(nèi)EG、CBH和BG三種酶的綜合做作用，其酶活性為 (1.045±0.030)IU/mg。

3 結(jié)論與討論

昆蟲與環(huán)境中的纖維素接觸非常密切，越來越多的研究證實(shí)等翅目、鞘翅目、鱗翅目、雙翅目昆蟲具有纖維素酶活性，它們是自然界中協(xié)助進(jìn)行碳循環(huán)的一類重要的昆蟲。如斑蝥 (Sami et al.，2011)、白蟻 (Nathan et al.，2011;曾文慧等，2011;Tokuda et al.，2012)、草地貪衣蛾(Marana et al.，2004)和大蚊科 (Willis et al.，2010)等已有纖維素酶活性的報(bào)道。本研究以濾紙為底物證實(shí)家蠅具有纖維素酶活性，這為家蠅能夠從富含纖維素的物質(zhì)中獲得生存所需的能量提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。家蠅正是由于體內(nèi)存在高效的纖維素酶才具有將纖維素轉(zhuǎn)化為自身新陳代謝所需小分子碳水化合物的能力。目前已有白蟻纖維素酶在消化道定位的報(bào)道 (曾文慧等，2011)，天牛的纖維素酶存在部位也有了一些研究 (Wei et al.，2006;索風(fēng)梅等，2007)。但沒有學(xué)者對(duì)家蠅纖維素酶種類和分布進(jìn)行研究。本研究通過纖維素酶復(fù)合酶系3種酶的特異性底物檢測(cè)到家蠅3齡幼蟲唾液腺、前腸、中腸和后腸粗酶液均具有β－葡萄糖苷酶、內(nèi)切β－1，4－葡聚糖酶和外切β－1，4－葡聚糖酶，為進(jìn)一步研究家蠅消化纖維素的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

纖維素酶作為一種復(fù)雜酶系，酶系中各種酶發(fā)揮各自作用將纖維素降解為單糖。根據(jù)作用方式，首先EG水解纖維素非結(jié)晶區(qū)生成大量還原性或非還原性末端;然后CBH再進(jìn)行降解生成大量纖維二糖，最后再由BG將纖維二糖水解成葡萄糖，從而完成降解纖維素的反應(yīng) (Beguin and Aubert，1994)。在纖維素降解的過程中可能存在酶的活性中心與不同底物間的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用(王驥，2003;段旭等，2009)。這種競(jìng)爭(zhēng)必將導(dǎo)致生成的單糖 (葡萄糖)的量減少。從混合底物實(shí)驗(yàn)結(jié)果中得到證實(shí)，家蠅纖維素酶系各酶系組分間也顯示出生成單糖減少。

在進(jìn)一步分析家蠅纖維素酶的性質(zhì)中可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，能夠更好的促進(jìn)家蠅纖維素酶酶促反應(yīng)。在不同溫度下用粗酶液與底物作用，家蠅纖維素酶對(duì)溫度比較敏感。在較低溫度下，酶與底物親和性弱，酶的活性顯著降低，這可能與它的生活習(xí)性有關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)家蠅纖維素酶與環(huán)毛蚓 (張炎，2006)和黑胸散白蟻 (許利霞等，2012)比較，顯示出較好的穩(wěn)定性且具有較高活性。這表明家蠅纖維素酶具有很好的應(yīng)用前景。

在家蠅的消化系統(tǒng)內(nèi)，纖維素酶的主要組成及其分布各不相同。這可能是與家蠅消化器官的功能不同造成的。家蠅的唾液腺主要是分泌唾液對(duì)吞咽食物起到潤(rùn)滑和幫助消化作用，因此纖維素酶較為豐富，而前腸是儲(chǔ)存食物和調(diào)節(jié)食物進(jìn)入中腸的作用，所以該處的酶活性較低。家蠅中腸是消化吸收的最主要的部位，其體積約占了消化道總長(zhǎng)度的3/4，使食物有充分的時(shí)間與纖維素酶作用，因此該處的酶活性最高，后腸是排出食物殘?jiān)⒋x廢物和吸回水分等的部位，不是降解纖維素酶的主要部位，所以酶活性也相對(duì)最低。本研究從對(duì)該物種纖維素酶分布情況進(jìn)行分析，為家蠅纖維素酶主要是家蠅自身分泌提供了理論依據(jù)。

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