水飛薊蛋白組分的理化特性研究

朱淑云 董 英 肖 香 張珊珊 秦云云

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013）

水飛薊［Silybum Marianum（L.）Gaertn］為菊科水飛薊屬草本植物，原產(chǎn)于地中海沿岸，現(xiàn)在歐洲、北美洲、亞洲、非洲等地區(qū)廣泛栽培，在我國的陜西、黑龍江、遼寧、江蘇、湖北等省也有種植。水飛薊作為一種傳統(tǒng)的藥用植物，主要利用其籽實。水飛薊籽由殼和仁兩部分組成，其藥用成分水飛薊素主要存在于殼中，籽仁中主要含蛋白質(zhì)、油脂和淀粉等［1－2］。

目前國內(nèi)外對水飛薊的研究主要集中在對水飛薊素的開發(fā)利用上，對水飛薊蛋白的研究較少［3－5］。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊籽仁脫脂粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達47.23%，水飛薊蛋白主要以清蛋白為主，占總蛋白的42.94%，它的質(zhì)量對水飛薊蛋白質(zhì)的品質(zhì)、特性有著重要影響。球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白在總蛋白中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10.1%、4.36%和0.61%［6］。有關(guān)水飛薊各蛋白組分的理化性質(zhì)和功能特性的研究尚未見報道。

本試驗以經(jīng)過脫脂處理的水飛薊籽仁為原料，研究水飛薊蛋白組分的理化性質(zhì)與功能特性，為將水飛薊蛋白開發(fā)為新資源食品奠定基礎(chǔ)，也為提高水飛薊資源綜合利用率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水飛薊籽仁:江蘇中興藥業(yè)有限公司提供，通過低溫加壓溶劑萃取技術(shù)脫脂，將脫脂水飛薊粉過80目篩備用；大豆油:市售；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

WFJ7200可見光分光光度計:尤尼柯上海儀器有限公司；ALPHAI－4/2－4型冷凍干燥機:德國CHRIST公司；Agilent 1100液相色譜:美國安捷倫公司；DYY－Ⅲ23A型電泳槽和ECP300三恒多用電泳儀:北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 水飛薊蛋白組分的制備

參考朱淑云等［6］的方法，分別提取水飛薊清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，所得上清液經(jīng)中和、濃縮后冷凍干燥得到各蛋白樣品（球蛋白需透析48 h）。

1.3.2 水飛薊蛋白組分的SDS－PAGE電泳分析

采用SDS－PAGE不連續(xù)緩沖系統(tǒng)進行電泳［7］。使用垂直板電泳槽，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，采用考馬斯亮藍R－250染色。

1.3.3 水飛薊蛋白組分的氨基酸組成分析

采用酸水解法［8］。

1.3.4 水飛薊蛋白組分營養(yǎng)特性分析

1.3.4.1 必需氨基酸與總氨基酸之比

采用Chavan等［9］報道的方法計算必需氨基酸比例:

E/T＝Ile＋Leu＋Lys＋Met＋Cys＋Phe＋Tyr＋Thr＋Val＋His/Ala＋Asp＋ Arg＋Gly＋Glu＋Ile＋Leu＋Lys＋Met＋Cys＋Phe＋Tyr＋Pro＋Ser＋Thr＋Val＋His×100%

1.3.4.2 氨基酸評分（AAS）

根據(jù)FAO/WHO1993年建議的每克氨基酸評分標(biāo)準(zhǔn)模式進行營養(yǎng)價值評定，氨基酸評分按下式計算:

1.3.4.3 蛋白質(zhì)效率比（PER）［10］

根據(jù)以下方程計算蛋白質(zhì)效率比:

式中:PER為蛋白質(zhì)效率比；HLeu為Leu在蛋白中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；HPro為Pro在蛋白中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；HTyr為Tyr在蛋白中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；HMet為Met在蛋白中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；HHis為His在蛋白中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.4.4 蛋白質(zhì)的體外消化率

稱取0.2 g蛋白樣品，溶解于20 mL pH 1.5的HCl溶液中，加入胃蛋白酶（1∶8 000 U/g蛋白），置于37℃恒溫水浴反應(yīng)2 h，調(diào)節(jié)至pH 7.0，加入胰蛋白酶（1∶8 000 U/g蛋白）再恒溫水浴消化2 h，加入等體積10%三氯乙酸終止反應(yīng)，靜置10 min后離心分離，同時做空白。氮的含量采用凱氏定氮法測定。體外消化率的計算公式如下:

1.3.4.5 蛋白質(zhì)消化率校正的氨基酸分?jǐn)?shù)（PDCAAS）［11］

PDCAAS按下式計算:PDCAAS＝最小氨基酸評分分?jǐn)?shù)×蛋白體外消化率

1.3.5 水飛薊蛋白組分的功能特性

1.3.5.1 溶解性的測定［12］

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蛋白溶液，分別用0.5 mol/L HCl或 NaOH調(diào)節(jié)至 pH 2.0～9.0，室溫下攪拌30 min，4 000 r/min離心20 min。用考馬斯亮藍比色法測定上清液中的蛋白含量。將適量蛋白粉完全溶解在一定pH的水溶液中，用考馬斯亮藍比色法測得的蛋白含量作為總蛋白含量。用以下公式計算蛋白的溶解性（PS）。

1.3.5.2 持水性和持油性的測定［13］

取0.2 g蛋白樣品加2.0 mL水或大豆油置于離心管中，混勻1 min后，在室溫下靜置30 min，然后以4 000 r/min離心30 min，測量上清液體積，結(jié)果以每克蛋白質(zhì)所吸水或油的體積表示（mL/g）。

1.3.5.3 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定［14］

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蛋白樣品溶液，調(diào)節(jié)至pH 7.0，室溫攪拌20 min后，轉(zhuǎn)入勻漿機高速攪打2 min，記錄攪打停止時泡沫體積和停止后30 min時的泡沫體積。

1.3.5.4 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定［15］

用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制6 mL 0.5%的蛋白質(zhì)懸浮液，分別加入2 mL大豆油，高速勻漿乳化1 min，立即用微量取樣器從溶液底部吸取20μL乳濁液，加到5 mL 0.1%SDS溶液中，于500 nm測定吸光值A(chǔ)0，靜置10 min后重新從乳濁液底部取樣測定吸光值得At。

式中:t為2次測定乳化性的時間間隔（t＝10）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均進行3次重復(fù)試驗，并取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 水飛薊蛋白組分的SDS－PAGE電泳分析

水飛薊蛋白組分的SDS－PAGE電泳分析見圖1。

從圖1中可以看出，水飛薊各蛋白組分的分子質(zhì)量分布廣泛，條帶較多。清蛋白約有14條譜帶，主要條帶比較集中的分布在32.4～44.5 ku和14.5～24.8 ku 2個區(qū)域；球蛋白大約有16條譜帶，高分子質(zhì)量條帶比清蛋白多，主要條帶分布與清蛋白相近，這是因為采用傳統(tǒng)的Osbome分級分離的方法難免會造成清蛋白和球蛋白的相互污染，造成“你中有我，我中有你”的情況［8］；谷蛋白主要有9條譜帶，而且條帶較淺，這可能與其溶解性較低，不能很好的溶解并進入到凝膠中有關(guān)。醇溶蛋白由于溶解性較差，純度較低，所以電泳未測出清晰的條帶（圖略）。

圖1 水飛薊蛋白組分的SDS－PAGE電泳圖

2.2 水飛薊蛋白組分的氨基酸組成分析

本試驗樣品的前處理采用酸水解法，因此氨基酸含量測定中色氨酸含量未進行檢測，其他種類的氨基酸含量測定結(jié)果如表1所示。

表1 水飛薊蛋白組分中氨基酸的組成和含量（g/100g蛋白）

由表1可見，水飛薊各蛋白組分的氨基酸含量豐富，種類齊全，其中谷氨酸的含量最高，清蛋白中最高可達25.57%。谷氨酸不僅屬于鮮味氨基酸，在醫(yī)學(xué)上谷氨酸還用于治療肝性昏迷，改善兒童智力發(fā)育；其次，精氨酸、天冬氨酸在各蛋白組分中含量都很高，對嬰幼兒來說，精氨酸屬于必需氨基酸，在調(diào)節(jié)免疫力、輔助治療高氨血癥、肝臟機能障礙等疾病方面頗有效果；此外，清蛋白和球蛋白中亮氨酸和纈氨酸的含量較高，均在5%以上，這兩種氨基酸都屬于必需氨基酸，是重要的營養(yǎng)補劑，在治療肝臟疾病、抗菌、抗病毒等方面都有顯著效果。各蛋白組分的必需氨基酸含量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于FAO/WHO推薦模式中的成人氨基酸需求量，球蛋白的必需氨基酸含量基本符合兒童（賴氨酸含量略低）的FAO/WHO推薦模式，其他蛋白組分中賴氨酸和亮氨酸含量低于FAO/WHO推薦模式中兒童的氨基酸需求。

對各蛋白組分中的氨基酸按照它們的化學(xué)性質(zhì)進行歸類，計算不同種類氨基酸的分配比例如表2所示。

表2 水飛薊蛋白組分中不同種類氨基酸的構(gòu)成分布/%

清蛋白中酸性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（35%），其他蛋白中非極性氨基酸含量最高。橫向比較氨基酸在各蛋白組分中的含量，其中非極性氨基酸在谷蛋白中所占比例最大（38.86%），極性中性氨基酸在球蛋白中所占比例最大（24.58%），酸性氨基酸在清蛋白中最高，堿性氨基酸在醇溶蛋白中最高（20.86%）。

2.3 水飛薊蛋白組分的營養(yǎng)價值分析

蛋白質(zhì)是人類賴以生存的營養(yǎng)素之一，蛋白質(zhì)的含量和質(zhì)量是決定其營養(yǎng)價值的關(guān)鍵因素。而蛋白質(zhì)的質(zhì)量主要取決于其氨基酸的組成及分配比例。本試驗利用氨基酸組成計算水飛薊各蛋白組分的營養(yǎng)參數(shù)，結(jié)果如表3所示。

表3 水飛薊蛋白組分的營養(yǎng)評價

從表3數(shù)據(jù)可見，4種蛋白組分中，水飛薊谷蛋白的E/T值最高（44.85%），其次是球蛋白，醇溶蛋白最低；在各蛋白組分中，球蛋白的氨基酸評分最高（83），其次是清蛋白，醇溶蛋白最低；含硫氨基酸是水飛薊球蛋白和谷蛋白的第一限制性氨基酸，賴氨酸是水飛薊清蛋白、球蛋白和谷蛋白的第二限制性氨基酸；預(yù)測蛋白質(zhì)效率比（PER）常作為蛋白質(zhì)營養(yǎng)高低的評價指標(biāo)，PER越大其營養(yǎng)價值越高。通常認(rèn)為蛋白的PER大于2.0時，表明該蛋白具有較高的營養(yǎng)價值［9］。從表3可以看出，谷蛋白的PER最高，其次為球蛋白和清蛋白，醇溶蛋白的PER最小。

蛋白質(zhì)能否在體內(nèi)被吸收也是考察其營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)。水飛薊不同蛋白組分的體外消化試驗結(jié)果表明，清蛋白具有最高的體外消化率（92.55%），其次為球蛋白，而醇溶蛋白的體外消化率最低，僅為54.52%。因此，蛋白質(zhì)氨基酸評分即使很高，如果消化率很低，也不能被人體充分吸收，從而影響了該蛋白的營養(yǎng)價值。

為了綜合評價各蛋白組分的營養(yǎng)價值，分別計算了各蛋白組分的蛋白質(zhì)消化率校正的氨基酸分?jǐn)?shù)即PDCAAS值。其中，清蛋白的 PDCAAS最高為0.73，其次為球蛋白，醇溶蛋白的PDCAAS最低，僅為0.29。這說明清蛋白的營養(yǎng)價值最高，而醇溶蛋白的營養(yǎng)價值最低。球蛋白盡管氨基酸評分最高，但蛋白消化率較低而影響了其PDCAAS值。在用PDCAAS評價蛋白質(zhì)營養(yǎng)時，當(dāng)PDCAAS高于1.0的蛋白質(zhì)是能滿足人體必需氨基酸需要量的高質(zhì)量蛋白質(zhì)，低于1.0的低質(zhì)量蛋白質(zhì)的氨基酸組分不能滿足2～5歲兒童對氨基酸的需要量［11］。盡管清蛋白的PDCAAS較高，但仍然不能作為高質(zhì)量蛋白單獨使用。如果補充蛋白中限制性氨基酸含量或者與其他可以彌補其限制性氨基酸不足的蛋白混合使用，將會極大的提高其營養(yǎng)價值。

2.4 水飛薊蛋白的功能特性

2.4.1 水飛薊蛋白組分的溶解性

蛋白質(zhì)的溶解性是其最基本的功能性質(zhì)，因為它往往影響著蛋白質(zhì)其它的功能性質(zhì)，例如起泡性、乳化性、凝膠作用等。溶解性差的蛋白質(zhì)在食品加工中的應(yīng)用是非常有限的。影響蛋白質(zhì)溶解性的因素有很多，例如pH、溫度以及有機溶劑等。pH對各蛋白組分溶解性的影響如圖2所示。由圖2可見，水飛薊各蛋白組分的溶解度隨pH的升高呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，清蛋白的溶解曲線變化最明顯，在pH5附近的溶解度最低。在等電點附近，蛋白的溶解度最低，在高pH條件下（pH＞7.0），凈的負(fù)電荷的增加有利于蛋白溶解度的迅速增加，而在低pH條件下（pH＜3.0），蛋白溶解度的增加取決于正電荷的增加，清蛋白、球蛋白和谷蛋白在堿性條件的蛋白溶解性明顯高于酸性條件，而醇溶蛋白的溶解度在試驗pH范圍內(nèi)都較低，最低點在pH 5附近。

圖2 水飛薊蛋白組分的溶解性

2.4.2 水飛薊蛋白組分的其他功能特性

水飛薊各蛋白組分的持水性、持油性、乳化性和起泡性等見表4。

表4 水飛薊蛋白組分的功能特性

由表4可見，持水性和持油性最高的是谷蛋白，清蛋白的持水性最差，持油性最低的是醇溶蛋白，蛋白質(zhì)的持水能力和持油能力源于蛋白質(zhì)分子表面所含基團的性質(zhì)，由于各蛋白所含的基團不同所以其所表現(xiàn)出來的性質(zhì)也有所差異。

起泡性是蛋白質(zhì)的一項重要功能性質(zhì)，是蛋糕、面包、冰淇淋等食品加工過程中非常重要的質(zhì)量控制指標(biāo)，凡是影響蛋白質(zhì)內(nèi)在結(jié)構(gòu)及其聚集狀態(tài)的內(nèi)、外在因素，都會影響其起泡性。清蛋白由于具有較好的溶解性，溶液中有效的蛋白濃度較大，因此吸附到氣－液界面上的蛋白質(zhì)分子較多，有利于界面性質(zhì)的發(fā)揮，所以其起泡性最高，谷蛋白和醇溶蛋白由于溶解性較差，起泡性都較低，但清蛋白的泡沫穩(wěn)定性較低，原因尚待研究。

蛋白質(zhì)分子同時含有親水性和親油性基團，在油水混合液中可以擴散到油水界面形成油水乳化液，蛋白質(zhì)促使油和水形成乳化液并保持乳化液穩(wěn)定的能力即為蛋白質(zhì)的乳化特性。蛋白質(zhì)的乳化性與溶解性、表面疏水性以及表面電荷分布相關(guān)，溶解性和表面疏水性是決定蛋白乳化性的2個主要因素。可溶性蛋白能夠擴散并吸附在油－水界面，這是決定它們?nèi)榛院脡牡年P(guān)鍵因素，所以不溶性蛋白對乳化作用的貢獻很小［16］。試驗中清蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性最高，而醇溶蛋白因為其溶解性最低，所以它的乳化性和乳化穩(wěn)定性在各蛋白組分中也是最低的。當(dāng)然蛋白質(zhì)的乳化能力不僅與其溶解性有關(guān)，還與蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，蛋白分子中親水基和疏水基的比例對其乳化特性有較大影響，球蛋白雖然有較高的乳化性，但其乳化穩(wěn)定性卻較低。

3 結(jié)論

3.1 水飛薊各蛋白組分主要以中、低分子量蛋白為主，電泳條帶比較集中地分布在32.4～44.5 ku和14.5～24.8 ku兩個區(qū)域。

3.2 水飛薊各蛋白組分的氨基酸組成合理，種類齊全，富含賴氨酸；清蛋白中酸性氨基酸含量最高，其他蛋白中非極性氨基酸含量最高；氨基酸評分依次為球蛋白、清蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白；谷蛋白的蛋白質(zhì)效率比（PER）最高，其次為球蛋白和清蛋白，醇溶蛋白的PER最小；清蛋白具有最高的體外消化率和PDCAAS，醇溶蛋白的體外消化率和PDCAAS最低。

3.3 4種蛋白組分中清蛋白的溶解性最好，醇溶蛋白最低；清蛋白的持水性最差，谷蛋白的持水性和持油性最高，醇溶蛋白的持油性最低；清蛋白具有最高的起泡性和較低的泡沫穩(wěn)定性；清蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性在4種蛋白組分中最高，醇溶蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性在各蛋白組分中最低。

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