李飛俠王 文朱 佳黃厚才夏 智

（1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210029；2.江蘇省中醫院，江蘇 南京 210029；3.江蘇省中醫藥研究院，江蘇 南京 210028）

宣肺止嗽方為朱佳教授的經驗方，由炙麻黃5g、杏仁10g、牛蒡子 10g、蟬衣 6g、白前 10g、桑白皮 10g、紫菀 10g、佛耳草15g、全蝎3g、炙甘草5g十味藥組成，具有疏風宣肺、止嗽化痰之功效，主為感染后咳嗽（PIC）而設。感染后咳嗽的發病機制尚不甚明確，近年來國內外大多數學者認為PIC的發病機制與氣道神經源性炎癥關系密切[1-3]，其中最主要的是神經肽 P 物質（SP）、神經肽 A（NKA）、神經肽 B（NKB）、降鈣素基因相關肽（CGRP）增高介導的氣道慢性神經源性炎癥。本實驗應用動物模型就該方對氣道神經源性炎癥的作用機理做一些藥效學探索研究，以氣道炎癥改變及SP、NKA、NKB、CGRP等作為考察指標，旨在從現代醫學的角度，更好地挖掘該方的臨床應用價值。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級雄性純白SD大鼠60只（購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司），體重180～220g，動物許可證號為SCXK2010-0001。

1.2 藥物配制 宣肺止嗽方由江蘇省中醫藥研究院中藥制劑室制備。制備工藝：取麻黃，加水提取2次，每次加藥材10倍量水，提取1h，合并提取液，靜置12h，取上清液，減壓濃縮，浸膏放置備用；另取蟬衣、杏仁、牛蒡子、白前等其余9味，加水提取2次，每次加藥材10倍量水，提取1h，合并提取液，靜置12h，取上清液，減壓濃縮，浸膏與上述浸膏合并，繼續濃縮至每毫升相當于2.604g生藥的浸膏，作為樣品液。惠菲寧止嗽糖漿，惠氏制藥有限公司生產，批號：1107016。

1.3 主要試劑與儀器 內毒素（LPS）、辣椒素（Cap）購自美國 Sigma公司；SP、NKA、NKB和 CGRP酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，購自美國R&D公司，批號為 201211。Devilbiss 646型霧化器，購自美國Devilbiss公司，輸出流量為0.037mL/min，輸出口與雙室透明塑料盒的頭室相連接；TP-603T型傳感器，購自日本光電公司；華東電子DG5033A酶標儀，購自南京華東電子集團醫療裝備有限責任公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，購自國華電器有限公司；LOZ5-2型離心機，北京醫用離心機廠；BH-2型Olympus生物顯微鏡（JAPAN）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及感染后咳嗽模型制備 將60只SPF級雄性純白SD大鼠隨機分為6組，即空白組、模型組、陽性對照組（惠菲寧8mL/kg）和宣肺止嗽方低劑量（4.71g/kg）、中劑量（9.42g/kg）、高劑量（13.86g/kg）組，每組 10 只。造模方法按本課題組前期有關制作感染后咳嗽動物模型的研究，參照文獻[4-6]，略有改進，具體方法：除空白組以外其余各組大鼠置于特制的0.5m3煙室中，以鋸屑末50g+10支南京牌香煙點燃煙熏，每日熏煙30min，連續10d，每日1次。自由進食、飲水。第11、14、17天用乙醚淺麻醉該5組大鼠后，鼻腔滴入濃度為0.4mg/mL的LPS溶液，滴入量以體重 1μL/g 計算。第 12、13、15、16、18天， 將該 5組大鼠置于透明密閉容器中以1×10-4mol/L的辣椒素溶液霧化吸入激發，每次3min，每日1次。每日觀察各組大鼠狀態，并于第19天開始各組大鼠按10mL/kg的體積灌胃相應藥物，空白組給予等體積生理鹽水，每日1次，連續給藥15d。于最后1次灌胃后24h處死各組大鼠測定相關指標。

2.2 支氣管肺泡灌洗液中速激肽及細胞分類計數 將大鼠平放于手術臺上，將氣管連同心肺游離出置于臺上，用血管夾夾閉右主支氣管，將頂端鈍圓有孔的特制硅膠管插入氣管，手術線結扎固定。左側肺給予預溫37℃的生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，反復抽推3次，留置

1min后回抽BALF并收集，重復3次，每次2mL，每次回收液體置于冰塊上，經過兩層無菌紗布過濾于無菌離心管，回收計量（回收率約75%）。1500r/min低溫離心10min，BALF上清保存在-80℃冰箱中，ELISA法檢測速激肽SP、NKA、NKB及CGRP的含量。沉淀細胞用0.5mL PBS重懸，吹打均勻后取30μL在血細胞計數器下進行白細胞總數計算；另取30μL制作細胞涂片，常規HE染色，光學顯微鏡下按細胞形態進行分類計數（至少計數200個細胞），求出百分比。

2.3 肺組織病理學觀察 氣道灌洗完成后，迅速取下各組大鼠右肺，并取出右上葉修剪成0.5cm厚的塊狀，置于4%多聚甲醛固定6h，常規石蠟包埋切片，HE染色，觀察大體組織病變和炎癥細胞浸潤情況。

2.4 統計學方法 采用SPSS16.0進行數據統計分析。各組結果以（）表示。組間比較用t檢驗（方差齊性），方差不齊時用t’檢驗。P＜0.05認為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠BALF中細胞分類計數 結果顯示，各治療組與模型組相比，BALF中各炎癥細胞比率均降低，以宣肺止嗽方中劑量組最為顯著。見表1。

3.2 各組大鼠BALF中速激肽SP、NKA、NKB及CGRP含量結果顯示，與空白組比較，模型組各項指標均顯著升高；各治療組BALF中各項指標均較模型組降低，以宣肺止嗽方中劑量組最為顯著。見表2。

3.3 肺組織病理變化 空白組：可見支氣管上皮細胞完整，細胞呈假復層柱狀纖毛上皮，排列整齊，肺泡上皮完整，無明顯病理改變（見圖1-A）。模型組：可見支氣管上皮大面積壞死脫落，細支氣管管腔擴大，管壁及其周圍見大量淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，上皮細胞明顯增生，杯狀細胞增生，肺泡間隙稍增厚，未見明顯的炎癥細胞浸潤（見圖1-B）。陽性對照組：支氣管上皮細胞多灶壞死、脫落，伴上皮細胞輕度增生和杯狀細胞增生，管壁增厚，伴大量淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，肺泡結構未見明顯損傷（見圖1-C）。宣肺止嗽方低劑量組：可見支氣管上皮細胞少量的壞死脫落，管壁與周圍淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，管腔無明顯擴張，上皮細胞無明顯增生（見圖1-D）。宣肺止嗽方中劑量組：各級支氣管上皮細胞基本完好，無明顯的壞死和增生，伴少量的淋巴細胞浸潤，肺泡間隙稍增厚，無明顯炎癥細胞浸潤（見圖1-E）。宣肺止嗽方高劑量組：可見支氣管上皮細胞中度的壞死脫落，上皮細胞輕度增生，管壁稍增厚，伴淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，管腔輕度擴張，肺實質未見明顯損傷（見圖1-F）。

表1 各組大鼠BALF中細胞分類計數（）

表1 各組大鼠BALF中細胞分類計數（）

注：與空白組比較，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，***P＜0.001。

組別 動物數（只）劑量（g/kg）白細胞總數（×108/L）空白組10巨噬細胞（%）3.8±1.5淋巴細胞（%）82.32±2.34中性粒細胞（%）嗜酸粒細胞（%）10.78±1.40 6.69±1.510.21±0.077.2±1.5▲▲▲宣肺止嗽方高劑量組 10 13.86g/kg 5.4±1.5* 78.33±3.72*** 13.58±2.37*** 8.07±1.36*** 0.32±0.13模型組 10 66.67±2.50▲▲▲ 21.62±2.13▲▲▲ 11.32±1.48▲▲▲ 0.39±0.15▲▲宣肺止嗽方中劑量組 10 9.42g/kg 3.9±1.4*** 81.93±2.54*** 10.93±1.37*** 6.8±1.55*** 0.24±0.11*宣肺止嗽方低劑量組 10 4.71g/kg 4.2±1.3*** 79.40±2.70*** 12.50±1.38*** 7.71±1.79*** 0.40±0.16陽性對照組 10 8mL/kg 5.9±1.2 72.98±3.12*** 15.73±1.50*** 10.47±1.53 0.33±0.09

表2 各組大鼠BALF中速激肽含量（）

表2 各組大鼠BALF中速激肽含量（）

注：與空白組比較，▲▲▲P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別 動物數（只）劑量（g/kg）CGRP含量（pg/ml）160.97±9.6410 SP含量（ng/L）NKB含量（ng/L）空白組模型組 10 232.65±7.10▲▲▲ 73.66±2.98▲▲▲宣肺止嗽方高劑量組 10 13.86g/kg 225.73±3.79* 71.42±1.72宣肺止嗽方中劑量組 10 9.42g/kg 160.56±20.25*** 52.63±1.48***宣肺止嗽方低劑量組 10 4.71g/kg 176.82±21.02*** 59.92±2.16***陽性對照組 10 8mL/kg 228.51±5.05 72.32±1.96 NKA含量（ng/L）158.22±6.85 214.60±13.62201.24±7.00▲▲▲ 279.92±8.25▲▲▲190.74±6.35** 269.86±8.67*157.82±7.32*** 209.83±25.38***170.84±4.73*** 234.22±23.74***195.52±3.90* 269.40±13.5351.13±2.19

4 討論

感染后咳嗽（PIC）是一種較為常見的呼吸道疾病。在美國ACCP協會2006年版 《咳嗽的診斷和治療指南》和中國2009年版《咳嗽的診斷和治療指南》中，均獨立將感染后咳嗽歸為亞急性咳嗽。目前普遍認為，由支氣管肺C纖維興奮導致其含有的神經肽的釋放引起的神經源性炎癥在感染后咳嗽發病中起重要作用[7]。當C纖維受到刺激，產生神經沖動，激發神經遞質釋放，從而作用于多種效應細胞，產生神經源性炎癥，進而刺激RARs引起咳嗽[8-9]。所釋放的神經遞質主要包括P物質、神經肽A、神經肽B及降鈣素基因相關肽等，它們通過多種形式影響氣道組織誘發神經源性炎癥。SP作為氣道神經源性炎癥的核心介質，在炎癥疾病中的作用目前已經非常明確[10]?，F代醫學尚缺乏治療該病公認有效的藥物，而相關文獻報道中醫藥對感染后咳嗽有較好的療效，但有關中藥如何影響本病相關發病機制的研究較少。

本實驗采用小劑量內毒素（LPS）誘導模擬革蘭陰性菌感染的方法創建PIC動物模型，統計結果顯示：與空白組比較，模型組BALF中各類炎癥細胞比率均顯著升高，上清液中SP、NKA、NKB及CGRP含量均顯著升高，結合肺組織病理學改變，可證實該模型復制成功。本研究發現，各治療組大鼠BALF中各類炎癥細胞比率均降低，以宣肺止嗽方中劑量組最為顯著，其次為低劑量組；各治療組BALF上清液中 SP、NKA、NKB及CGRP含量均較模型組降低，以宣肺止嗽方中劑量組降低最為顯著。

綜上所述，感染后咳嗽的發病與神經遞質（以SP、NKA、NKB及CGRP為主）介導的神經源性炎癥有關，這與大部分的研究結果相似。宣肺止嗽方能降低此類神經遞質的含量，緩解氣道炎癥，促進疾病的恢復，其中尤以中劑量作用顯著，其次為低劑量，而該方高劑量療效不佳，可能是因為藥物濃度過高存在一定程度的藥物毒性。西藥惠菲寧對降低此類神經遞質含量及緩解氣道炎癥無顯著作用。結合肺組織病理學改變，本研究進一步證實了該方對感染后咳嗽良好的治療效果，并初步探討了相關作用機理，為該方的臨床應用提供科學合理的實驗依據，并提示中藥復方具有潛在的臨床應用前景。

[1]Folkerts G，NgKamp FP.Virus-induced airway hyperresponsiveness role of inflammatory cells and mediators.Am J Respir Crit Med，1995，150（5）：1666

[2]劉春麗，賴克風.氣道神經源性炎癥與慢性咳嗽的發病機制.國外醫學呼吸系統分冊，2004，24（4）：237

[3]陳如沖，劉春麗，羅煒.感染后咳嗽敏感性及氣道神經源性炎癥改變.中國實用內科雜志，2007，27（9）：674

[4]馬楠，崔德健，梁延杰，等.氣管內注入脂多糖法建立大鼠慢性支氣管炎模型.基礎醫學與臨床，2000，20（4）：87

[5]顧鵬程，許惠琴，范欣生，等.內毒素誘導致敏小鼠建立支氣管哮喘動物模型的實驗研究.中華結核和呼吸雜志，2010，33（1）：56

[6]王元勛，張敏華，蔡圣榮，等.肺氣虛證動物模型的研制.中國病理生理雜志，1994，10（1）：15

[7]Lee LY.Respiratory sensations evoked by activation of bronchopulmonary C-fibers.Respiratory physiology& neurobiology，2009，167（1）：26

[8]Lee LY，Shuei Lin Y，Gu Q，et al.Functional morphology and physiological properties of bronchopulmonary C-fiber afferents.The anatomical record，2003，270（1）：17

[9]Xiang A，Uchida Y，Nomura A，et al.Effects of airway inflammation on cough response in the guinea pig.J Appl Physiol，1998，85（5）：1847

[10]O'Connor TM，O'Connell J，O'Brien DI，et al.The role of substance P in inflammatory disease. J Cell Physiol，2004，201（2）：167