叢枝菌根真菌對(duì)農(nóng)藥三環(huán)唑的殘留減量研究

馬 放，李 哲，王 立，李世陽(yáng)，張淑娟，徐亞男

(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，150090 哈爾濱)

農(nóng)殘超標(biāo)帶來(lái)的食品安全問(wèn)題和農(nóng)藥過(guò)量施入帶來(lái)的嚴(yán)重面源污染風(fēng)險(xiǎn)是當(dāng)前的熱點(diǎn)問(wèn)題.我國(guó)2010年施用化學(xué)農(nóng)藥264.8萬(wàn) t［1］，過(guò)量施用的農(nóng)藥一方面以不同形式進(jìn)入到環(huán)境中，造成嚴(yán)重的面源污染［2－4］;另一方面在作物體內(nèi)蓄積，嚴(yán)重影響食品質(zhì)量［5］.2009年南方某地區(qū)水稻稻殼抽樣檢測(cè)結(jié)果表明，農(nóng)藥殘留超標(biāo)率達(dá)14.2%［6］.叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF)是一種內(nèi)生菌根真菌，可與地球上90%的維管植物根系結(jié)合，形成叢枝菌根結(jié)構(gòu)［7－9］.菌根化的植物對(duì)農(nóng)藥有很強(qiáng)的耐受性，并能把一些有機(jī)農(nóng)藥轉(zhuǎn)化為菌根真菌和植物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而降低農(nóng)藥造成的污染［10－11］.已有研究證明，接種AMF的植物根系能吸收土壤中殘留的DDT，降低土壤中和植物莖葉中的含量［12］.球囊霉 (Glomus intraradices，GI)和摩西球囊霉(Glomus mosseae，GM)是兩種廣適性的 AMF，能夠與大多數(shù)植物形成良好共生體系，具有良好的農(nóng)藥抗性與消解效能［13］，宋福強(qiáng)等于盆栽高粱條件下研究了AMF根內(nèi)GM、GI消解土壤中阿特拉津的效用，接種GM處理的土壤中阿特拉津最高消解率達(dá) 91.6%［14］.

針對(duì)北方稻區(qū)稻瘟病發(fā)病嚴(yán)重的現(xiàn)狀，選擇防治稻瘟病最常用的農(nóng)藥三環(huán)唑作為研究對(duì)象，比較兩種優(yōu)勢(shì)土著AMF(GM、GI)單獨(dú)施用和混合施用，對(duì)受不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)三環(huán)唑污染的水稻土壤及植株進(jìn)行生物修復(fù)，通過(guò)測(cè)定土壤及水稻植株中三環(huán)唑殘留量的變化，研究接種不同AMF對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)三環(huán)唑消解率的影響，并篩選出優(yōu)勢(shì)菌種，為研究AMF對(duì)土壤及水稻植株中的農(nóng)藥消解效果提供依據(jù).

1 試驗(yàn)

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣地:黑龍江省雙城市前進(jìn)鄉(xiāng)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室“農(nóng)用化學(xué)品源頭減量示范基地”(E:125°41'－126°42'，N:45°08'－45°43');試驗(yàn)田土壤中水解性氮110.43 mg/kg，有效磷422.37 mg/kg;pH為6.48.

供試菌劑:叢枝菌根真菌(AMF)廣適菌種，包括摩西球囊霉(GM)、根內(nèi)球囊霉(GI)、混合菌劑(GM+GI).

植物宿主:水稻(Oryza sativa)，品種為北稻4號(hào)，種子購(gòu)于黑龍江省農(nóng)科院.種子用水浸泡，30℃保濕催芽，待芽長(zhǎng)至約1 cm時(shí)，篩選長(zhǎng)勢(shì)相近的水稻種子用于試驗(yàn).

供試農(nóng)藥:三環(huán)唑75%可濕性粉劑(江蘇豐登農(nóng)藥有限公司)，三環(huán)唑原藥(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))純度99.6%.

1.2 試驗(yàn)田設(shè)計(jì)

試驗(yàn)田共4塊，分別按照三環(huán)唑正常施加量的50%、100%、150%、200%進(jìn)行噴藥，并設(shè)置不加藥的空白.每塊試驗(yàn)田的面積為8 m×8 m，于四周各留出1 m作為保護(hù)區(qū)，內(nèi)部6 m×6 m進(jìn)行試驗(yàn).將試驗(yàn)區(qū)按十字分成4塊，每塊大小為2.5 m×2.5 m，每小塊田之間留有1 m間隔，4塊小田分別設(shè)置接種摩西球囊霉、根內(nèi)球囊霉、兩種菌的混菌以及不接菌的處理.

施藥劑量及時(shí)間:75%三環(huán)唑可濕性粉劑，262.5 g/hm2(有效成分196.9 g/hm2，每塊小試驗(yàn)田面積為2.5 m×2.5 m，添加0.2 g原藥為正常(100%)施加量;三環(huán)唑施加時(shí)間為水稻苗期自然生長(zhǎng)一個(gè)月之后.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 AMF接種及測(cè)定

接種:水稻種子采用條播的方法，每個(gè)小區(qū)設(shè)計(jì)20垅，分別將不同設(shè)計(jì)的菌劑均勻撒入垅中.

侵染率測(cè)定:侵染率測(cè)定樣品采樣時(shí)間為水稻自然生長(zhǎng)一個(gè)月后.采用Phillip的KOH脫色－酸性品紅染色方法.隨機(jī)選取120條根段染色、制片，觀察侵染率變化，并根據(jù)十字交叉法計(jì)算菌根侵染率［16］.

菌根依賴性指數(shù)［17］IMD=接菌后植物生物量(M+)/未接菌植物生物量(M－)×100%.

1.3.2 采樣方法

分別于噴藥后2 h、1、3、5、7、10、14、21 d 進(jìn)行采樣.土壤樣品在每個(gè)小區(qū)采10個(gè)點(diǎn)，總量不少于1 kg，混勻后采用4分法留樣品500 g左右，盛放于封口塑料袋中，實(shí)驗(yàn)室－20℃保存.植株樣品在每個(gè)小區(qū)采10個(gè)點(diǎn)，總量不少于1 kg，剪碎混勻后采用4分法留樣品500 g左右，盛放于封口塑料袋中，實(shí)驗(yàn)室－20℃保存.

1.3.3 殘留提取方法

三環(huán)唑提取方法參考文獻(xiàn)［15］，并作適當(dāng)改進(jìn).

1.3.4 殘留量擬合方法

一級(jí)化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式為ln c=－Kt+ln c0，將其變形為c=c0e－Kt.將此公式應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得c=k0c0e－Kt，其中c0為施藥后三環(huán)唑的初始?xì)埩袅?c為施藥后間隔t時(shí)間的三環(huán)唑殘留量;K為消解速率常數(shù);k0為初始?xì)埩袅啃拚禂?shù);t為施藥后的天數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 菌劑侵染情況

自然條件下，仍可檢出AMF對(duì)水稻的侵染，表明自然基質(zhì)中水稻與土著AMF形成共生體的現(xiàn)象是普遍存在的，但是自然侵染率很低(3.34%)(圖1，2).

圖1 不同AMF菌劑施用小區(qū)水稻的侵染率

圖2 不同AMF菌劑施用小區(qū)水稻的菌根依賴性指數(shù)

與CK相比，人工強(qiáng)化施加菌劑可極顯著提高AMF對(duì)水稻的侵染作用(P＜0.05)，并可顯著提高菌根依賴性指數(shù)(P＜0.05).單獨(dú)施加菌劑時(shí)，GM(侵染率53.86%)對(duì)水稻的侵染效果優(yōu)于GI(侵染率34.57%)，且效果顯著(P ＜0.05).兩種菌劑混合施加時(shí)的侵染效果最好，侵染率達(dá)56.06%，顯著好于單獨(dú)施加GI(P＜0.05).單獨(dú)施加GM(IMD=164%)、GI(IMD=142%)和施加混合菌劑(IMD=160%)的處理之間菌根依賴性指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.結(jié)果表明，GM+GI對(duì)水稻的侵染效果最佳，侵染效果優(yōu)于單菌.

2.2 AMF對(duì)土壤中三環(huán)唑殘留的影響

以田間施用量為標(biāo)準(zhǔn)，模擬減半和倍增質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度設(shè)計(jì)，考察不同梯度三環(huán)唑質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，AMF對(duì)土壤殘留的影響.測(cè)得不同處理在不同時(shí)間的殘留量，擬合出消解曲線，得消解動(dòng)態(tài)方程.根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，稻田土壤中三環(huán)唑的殘留量與其施用后的取樣時(shí)間之間呈較明顯的負(fù)指數(shù)關(guān)系，采用一級(jí)化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式進(jìn)行模擬.

根據(jù)實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)三環(huán)唑在土壤中的殘留量在第3天達(dá)到最大值，第3天以后開(kāi)始下降，因此，殘留擬合從第3天開(kāi)始，共取6個(gè)點(diǎn)(圖3、表1).

表1 不同AMF菌劑施用小區(qū)土壤中三環(huán)唑殘留量隨時(shí)間變化的擬合

圖3 不同AMF菌劑施用小區(qū)土壤中三環(huán)唑的殘留量隨時(shí)間變化

結(jié)果表明，在土壤的不同處理中，施加菌劑的處理三環(huán)唑的消解速率均不同程度地大于CK，半衰期均低于CK，表明AMF的加入對(duì)土壤中三環(huán)唑的消解有明顯的促進(jìn)作用.

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理?xiàng)l件下，GM和GM+GI消解速率接近，均高于GI.在一定范圍內(nèi)隨著三環(huán)唑質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，其在土壤中的消解速率也逐漸加快，在1.5倍田間施用三環(huán)唑質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，其消解速率最快，超過(guò)這一質(zhì)量分?jǐn)?shù)三環(huán)唑的消解速率明顯下降，表明AMF對(duì)田間正常施用質(zhì)量分?jǐn)?shù)的三環(huán)唑具有一定的耐藥性，超過(guò)1.5倍田間施用質(zhì)量分?jǐn)?shù)AMF活性將受到抑制.

加入菌劑后土壤中三環(huán)唑的半衰期明顯低于不加菌劑的空白.GI在50%低質(zhì)量分?jǐn)?shù)下對(duì)土壤中三環(huán)唑消解影響最大，GM在150%高質(zhì)量分?jǐn)?shù)下對(duì)土壤中三環(huán)唑消解影響最大.GM+GI在質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%和200%情況下效果最好，并且在4種質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理下效果穩(wěn)定.3種不同菌劑處理在農(nóng)藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)150%時(shí)半衰期最低，能發(fā)揮最大效應(yīng).

取土壤不同處理在21 d的消解率作圖，結(jié)果如圖4.

圖4 施藥21 d后不同處理水稻土壤中三環(huán)唑消解率

GM的侵染率低于GM+GI，但在不同處理里GM的消解率均為最大，說(shuō)明GM的促消解效果優(yōu)于GM+GI.GM+GI的侵染率最高，在4種質(zhì)量分?jǐn)?shù)下效果較穩(wěn)定.

綜上，土壤中3種菌劑處理對(duì)三環(huán)唑的消解效果由大到小為GM+GI＞GM＞GI，4種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下菌劑在150%施藥情況下可以發(fā)揮最好效果.因此，在土壤中加入150%質(zhì)量分?jǐn)?shù)摩西和根內(nèi)混合菌劑的情況下三環(huán)唑消解情況最好.

2.3 AMF對(duì)水稻植株中三環(huán)唑殘留的影響

以田間施用量為標(biāo)準(zhǔn)，模擬減半和倍增質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度設(shè)計(jì)，考察不同梯度三環(huán)唑質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，AMF對(duì)水稻植株中殘留的影響.測(cè)得不同處理在不同時(shí)間的殘留量，擬合出消解曲線，得消解動(dòng)態(tài)方程.根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，水稻植株中三環(huán)唑的殘留量與其施用后的取樣時(shí)間之間呈較明顯的負(fù)指數(shù)關(guān)系，采用一級(jí)化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式進(jìn)行模擬.

根據(jù)實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)，三環(huán)唑在水稻植株中消解較快，在第14天消解率已全部達(dá)90%以上，因此，殘留擬合的最后一點(diǎn)取第14天即可，共計(jì)7個(gè)點(diǎn)(圖5、表2).

表2 不同AMF菌劑施用小區(qū)水稻植株中三環(huán)唑殘留量隨時(shí)間變化的擬合

圖5 不同AMF菌劑施用小區(qū)水稻植株中三環(huán)唑的殘留量隨時(shí)間變化

結(jié)果表明，在水稻植株的不同處理中，施加菌劑的處理三環(huán)唑的消解速率均不同程度地大于CK，半衰期均低于CK，表明AMF的加入對(duì)水稻植株中三環(huán)唑的消解有明顯的促進(jìn)作用.

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理?xiàng)l件下，GM消解速率最大，均高于GI和GM+GI.在一定范圍內(nèi)隨著三環(huán)唑質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，其在水稻植株中的消解速率也逐漸加快，在1.5倍田間施用三環(huán)唑質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，其消解速率最快，超過(guò)這一質(zhì)量分?jǐn)?shù)三環(huán)唑的消解速率明顯下降，表明AMF對(duì)田間正常施用質(zhì)量分?jǐn)?shù)的三環(huán)唑具有一定的耐藥性，超過(guò)1.5倍田間施用質(zhì)量分?jǐn)?shù)AMF活性將受到抑制.

加入菌劑后水稻植株中三環(huán)唑的半衰期明顯低于不加菌劑的空白.不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理下，3種菌劑對(duì)三環(huán)唑的半衰期影響效果大小為GM＞GM+GI＞GI.GI在農(nóng)藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)200%時(shí)半衰期最短，說(shuō)明GI可以在農(nóng)藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)發(fā)揮最好效果.GM和GM+GI在農(nóng)藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)150%時(shí)半衰期最短.

取水稻植株不同處理在14 d的消解率作圖，結(jié)果如圖6.

圖6 施藥14 d后不同處理水稻植株中三環(huán)唑消解率

GM的侵染率低于GM+GI，但在不同處理里GM的消解率均為最大，說(shuō)明GM的促消解效果優(yōu)于 GM+GI.

綜上，水稻植株中3種菌劑處理對(duì)三環(huán)唑的消解效果由大到小為GM＞GM+GI＞GI，GM和GM+GI在150%施藥情況下可以發(fā)揮最好效果.

3 討論

3.1 菌劑侵染及菌根依賴性

AMF自然侵染率很低(3.34%)，人工強(qiáng)化施加菌劑可極顯著提高AMF對(duì)白三葉草的侵染作用(P＜0.05)，并可顯著提高菌根依賴性指數(shù)(P＜0.05).GM+GI對(duì)水稻的侵染效果(侵染率56.06%)最佳，侵染效果優(yōu)于 GM(侵染率53.86%)和GI(侵染率34.57%).

3.2 AMF對(duì)土壤中三環(huán)唑殘留的影響

施加菌劑的處理三環(huán)唑的消解速率均不同程度地大于CK，半衰期均低于CK，表明AMF的加入對(duì)土壤中三環(huán)唑的消解有明顯的促進(jìn)作用.

土壤中3種菌劑處理對(duì)三環(huán)唑的消解效果由大到小為GM+GI＞GM＞GI，4種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下菌劑在150%施藥情況下可以發(fā)揮最好效果，即在土壤中加入150%質(zhì)量分?jǐn)?shù)摩西和根內(nèi)混合菌劑的情況下三環(huán)唑消解情況最好.

3.3 AMF對(duì)水稻植株中三環(huán)唑殘留的影響

在水稻植株的不同處理中，施加菌劑的處理三環(huán)唑的消解速率均不同程度地大于CK，半衰期均低于CK，表明AMF的加入對(duì)水稻植株中三環(huán)唑的消解有明顯的促進(jìn)作用.

水稻植株中3種菌劑處理對(duì)三環(huán)唑的消解效果由大到小為GM＞GM+GI＞GI，GM和GM+GI在150%施藥情況下可以發(fā)揮最好效果.

4 結(jié)論

1)人工施加菌劑可極顯著地提高AMF對(duì)水稻的侵染效果.

2)AMF的加入促進(jìn)了稻田土壤中三環(huán)唑的消解，效果由大到小為GM+GI＞GM＞GI.

3)AMF的加入促進(jìn)了水稻植株中三環(huán)唑的消解，效果由大到小為GM＞GM+GI＞GI.

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