響應面法優化木薯淀粉制備低聚異麥芽糖工藝

王鎮發 李夏蘭 陳培欽

（華僑大學化工學院生物工程系，廈門 361021）

低聚異麥芽糖（isomaltooligosaccharide，IMO），是淀粉糖的一種，主要成分為α－1，6－糖苷鍵結合的異麥芽糖（IG2）、潘糖（P）、異麥芽三糖（IG3）及四糖（含四糖）以上（Gn）的低聚糖［1］。低聚異麥芽糖具有促進雙歧桿菌超強增殖、抗齲齒、消除疲勞、促進鈣的吸收、增強機體免疫力、潤腸通便等生理功能［2－4］。又因其具有低甜度、低熱值、低黏度、保濕性、非發酵性、耐酸熱性等特性，所以被廣泛應用于各類保健品、飲品、奶制品、糖果和面食等［5］。它是功能性低聚糖中產量最大，應用最廣泛，集營養、保健、療效于一體的被稱為21世紀的新型生物糖源。

以玉米淀粉為原料制備低聚異麥芽糖目前已經實現工業化，但是以木薯淀粉為原料制備低聚異麥芽糖的研究較少。木薯淀粉的粗蛋白、脂肪和灰分含量比玉米淀粉少，而支鏈淀粉比玉米高，水解產物的分支低聚糖含量更高，這些特性對生產分支低聚糖都非常有利［6－8］。我國木薯資源豐富，利用木薯淀粉為原料采用多種酶聯合作用制備低聚異麥芽糖，可以大幅度提高木薯淀粉資源的附加值，同時為木薯資源的綜合利用開辟一條新的途徑。

1　材料與方法

1.1　原料與試劑

木薯淀粉：聚祥（廈門）淀粉有限公司。葡萄糖，麥芽糖，異麥芽糖，麥芽三糖，潘糖，異麥芽三糖：均為色譜純，美國sigma公司；乙腈：霍尼韋爾中國有限公司；耐高溫α－淀粉酶（酶活為68 U／mL，自制稀釋）、真菌α－淀粉酶（酶活為306 U／mL）、β－淀粉酶（酶活為13 U／mL）：諾維信中國有限公司；普魯蘭酶（酶活為11 U／mL，自制稀釋）：無錫杰能科生物工程有限公司；α－轉葡萄糖苷酶（酶活為13 U／mL，自制稀釋）：日本天野制藥株式會社；其他常規試劑均為國產或進口分析純。

1.2　試驗設備

Agilent1100高效液相色譜儀：美國 Agilent公司；電熱恒溫振蕩水槽DKZ－2型：上海精宏實驗設備有限公司；奧立龍CHNO60型pH計：上海華東電器集團有限公司。

1.3　試驗方法

1.3.1 木薯淀粉制備低聚異麥芽糖工藝流程

需要說明的是，在木薯淀粉制備低聚異麥芽糖過程中糖化和轉苷的溫度和pH相同；低聚異麥芽糖的主要成分為異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖［9］，分析對象為這3種糖之和。

1.3.2 響應面法試驗設計

單因素試驗考慮了液化時間、糖化時間、真菌α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普魯蘭酶酶量、糖化轉苷溫度、糖化轉苷pH、α－轉移葡萄糖苷酶酶量對異麥芽糖、潘糖以及異麥芽三糖之和（簡稱：IG2＋P＋IG3）的影響。根據單因素試驗結果選取真菌α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普魯蘭酶酶量、糖化轉苷溫度、糖化轉苷pH、α－轉移葡萄糖苷酶酶量6個因素和IG2＋P＋IG3作為響應值進行6因素三水平的Box－Behnken響應面設計。采用高效液相色譜法分析異麥芽糖、潘糖以及異麥芽三糖的含量［1］。

1.3.3 響應面法試驗數據分析

利用Design Expert 8.0.6軟件中的Box－Behnken Design模型，對上述6個因素進行響應面分析，并對所獲得的響應面回歸模型進行顯著性檢驗。

2　結果與討論

2.1　單因素試驗

液化時間從50到190 min，IG2＋P＋IG3在不斷降低，這是因為隨著時間的增加淀粉液化的DE值不斷增加，而低的DE值有利于生成較多的低聚異麥芽糖和較少的葡萄糖；又當液化時間為40 min時液化后的木薯淀粉液很容易退化，不易進行試驗，所以液化時間選為50 min。糖化時間從0～8 h，間隔2 h做一組試驗，結果糖化時間為4 h時IG2＋P＋IG3最大且所用時間最短。糖化轉苷在pH 4.0～5.4這個范圍內，IG2＋P＋IG3隨著pH的增大而增加；當pH大于5.4，IG2＋P＋IG3隨著pH的增大而減少。糖化轉苷溫度范圍35～60℃，在40℃時IG2＋P＋IG3最大。當β－淀粉酶添加量從0～0.20 mL時，IG2＋P＋IG3隨著添加量的增加而迅速增加；當添加量大于0.20 mL時，IG2＋P＋IG3稍微減少一些，當添加量大于0.30 mL時，IG2＋P＋IG3趨向平衡，基本不變。當普魯蘭酶添加量從0～0.20 mL時，IG2＋P＋IG3隨著添加量的增加而迅速增加；當添加量大于0.20 mL時，IG2＋P＋IG3隨之減少。當 α－淀粉酶添加量從0～0.30 mL時，IG2＋P＋IG3隨著添加量的增加而迅速增加；當添加量大于0.30 mL時，IG2＋P＋IG3稍微減少一些，當添加量大于0.40 mL時，IG2＋P＋IG3趨向平衡，基本不變。當α－轉移葡萄糖苷酶添加量從0.02～0.10 mL時，IG2＋P＋IG3隨著添加量的增加而迅速增加；當添加量大于0.10 mL時，IG2＋P＋IG3隨著添加量的增加而減少。

2.2　Box－Behnken試驗

根據單因素考察結果選取溫度（X1，℃）、pH（X2）、α－淀粉酶酶量（X3，mL）、β－淀粉酶酶量（X4，mL）、普魯蘭酶酶量（X5，mL）和 α－轉移葡萄糖苷酶酶量（X6，mL）作為考察因素，采用 Box－Behnken法6因素3水平進行試驗，以IG2＋P＋IG3（R，mg／mL）作為響應值。試驗安排及試驗結果如表1。

表1　響應面試驗安排表及結果

利用Design Expert軟件，對數據進行多元回歸擬合，獲得以IG2＋P＋IG3對溫度、pH、α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普魯蘭酶酶量和α－轉移葡萄糖苷酶酶量的二次多項回歸方程：R＝101.22－5.37X1＋3.05X2＋1.61X3－0.61X4＋2.47X5－6.16X6＋2.70X1X2－2.48X1X3＋0.31X1X4－1.79X1X5－0.55X1X6－2.03X2X3＋2.43X2X4－2.02X2X5＋5.47X2X6＋0.74X3X4＋1.14X3X5－0.018X3X6－0.89X4X5－1.55X4X6＋0.57X5X6－10.17X12－11.50X22－5.33X32－2.95X42－7.09X52－7.21X62

從回歸模型方差（表2）可知，試驗所選用的二次多項模型 F值為9.033，“Prob＞F”＜0.000 1，具有顯著性；失擬項為0.158 0，影響不顯著，說明模型不失擬；整個模型R2＝0.907 0，變異系數5.79%，表明方程的因變量與全體自變量之間的回歸效果顯著，此模型擬合較好。

表2　響應面試驗方差分析結果

由表 2方差分析結果可知，X1、X2、X5、X6、X2X6、X12、X22、X32、X52、X62對生成IG2＋P＋IG3有顯著或極顯著的影響，其他因素影響相對較??；方程的一次項和二次項（P＜0.05）比較顯著，因素的交叉項（P＞0.05）相互作用不顯著，說明各個具體試驗因素對響應值的影響是二次拋物面的關系，而各個因素之間的交互作用在試驗中影響不大。

2.3　響應面分析

通過Design－Expert統計分析軟件作響應曲面，可以直觀地分析溫度、pH、α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普魯蘭酶酶量和α－轉移葡萄糖苷酶酶量6個因素之間交互作用對IG2＋P＋IG3的影響，結果見圖1～圖15所示。

從圖1可知，IG2＋P＋IG3量受pH和溫度共同影響，隨著pH的增大，IG2＋P＋IG3量不斷增加，但pH超過5.5，則不利于IG2＋P＋IG3量的增加；隨著溫度的升高，IG2＋P＋IG3量不斷增加，在40℃左右達到最大值，之后隨著溫度的升高，IG2＋P＋IG3量不斷下降；pH 5.50，溫度為40℃時，IG2＋P＋IG3量達到最大值。從圖2可知，IG2＋P＋IG3量受α－淀粉酶酶量和溫度共同影響，當溫度為35℃或者55℃時，增加α－淀粉酶酶量對IG2＋P＋IG3量的增加影響不大；當溫度為40℃、α－淀粉酶酶量為0.25 mL（76.5 U）時，IG2＋P＋IG3量達到最大。從圖3可知，β－淀粉酶酶量與溫度相比，溫度的改變對IG2＋P＋IG3量的影響更大；當溫度為45℃、β－淀粉酶酶量為0.15 mL（1.95 U）時，IG2＋P＋IG3量達到最大。從圖4可知，IG2＋P＋IG3量受普魯蘭酶酶量和溫度共同影響，當普魯蘭酶酶量為0.25 mL（2.75 U）、溫度為45℃時，IG2＋P＋IG3量達到最大。從圖5可知，IG2＋P＋IG3量受α－轉移葡萄糖苷酶酶量和溫度共同影響，當α－轉移葡萄糖苷酶酶量為0.10～0.15 mL（1.3～1.95 U）、溫度為40～45℃時，IG2＋P＋IG3量達到最大。從圖6至圖9可知，IG2＋P＋IG3量受α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普魯蘭酶酶量、α－轉移葡萄糖苷酶和溫度共同影響，適當的酶量和溫度有利于IG2＋P＋IG3量的增加。從圖10可知，α－淀粉酶和β－淀粉酶相互作用對IG2＋P＋IG3的影響不大。從圖11可知，普魯蘭酶酶量的變化比α－淀粉酶酶量的變化對IG2＋P＋IG3量的影響更大。從圖12可知，α－轉移葡萄糖苷酶酶量的變化比α－淀粉酶酶量的變化對IG2＋P＋IG3量的影響更大。從圖13可知，普魯蘭酶酶量的變化比β－淀粉酶酶量的變化對IG2＋P＋IG3的影響更大。從圖14可知，α－轉移葡萄糖苷酶酶量的變化比β－淀粉酶酶量的變化對IG2＋P＋IG3量的影響更大。從圖15可知，α－轉移葡萄糖苷酶和普魯蘭酶共同影響IG2＋P＋IG3的量，α－轉移葡萄糖苷酶酶量為0.10～0.15 mL（1.3～1.95 U）、普魯蘭酶酶量為0.25～0.35 mL（2.75～3.85 U）時，更有利于IG2＋P＋IG3量的增加。從上述分析可知pH和溫度與酶的相互影響比較大，酶與酶之間的相互影響比較小。

圖1　pH和溫度對IG2＋P＋IG3的影響

圖2　α－淀粉酶和溫度對IG2＋P＋IG3的影響

圖3　β－淀粉酶和溫度對IG2＋P＋IG3的影響

圖4　普魯蘭酶和溫度對IG2＋P＋IG3的影響

圖5　α－轉移葡萄糖苷酶和溫度對IG2＋P＋IG3的影響

圖6　α－淀粉酶和pH對IG2＋P＋IG3的影響

圖7　β－淀粉酶和pH對IG2＋P＋IG3的影響

圖8　普魯蘭酶和pH對IG2＋P＋IG3的影響

圖9　α－轉移葡萄糖苷酶和pH對IG2＋P＋IG3的影響

圖10　α－淀粉酶和β－淀粉酶對IG2＋P＋IG3的影響

圖11　普魯蘭酶和α－淀粉酶對IG2＋P＋IG3的影響

圖12　α－轉移葡萄糖苷酶和α－淀粉酶對IG2＋P＋IG3的影響

圖13　普魯蘭酶和β－淀粉酶對IG2＋P＋IG3的影響

圖14　α－轉移葡萄糖苷酶和β－淀粉酶對IG2＋P＋IG3的影響

圖15　α－轉移葡萄糖苷酶和普魯蘭酶對IG2＋P＋IG3的影響

2.4　優化工藝條件驗證

通過Design－expert軟件建立模型分析，得出以木薯淀粉（30%）為原料制備低聚異麥芽糖的最佳工藝條件：糖化轉苷溫度為41.9℃，糖化轉苷pH 5.45，真菌α－淀粉酶酶量為30.60 U／g（淀粉）、β－淀粉酶酶量為1.04 U／g（淀粉）、普魯蘭酶酶量為1.10 U／g（淀粉）和α－轉移葡萄糖苷酶酶量為0.48 U／g（淀粉）。液化條件固定為：耐高溫α－淀粉酶酶量為2.27 U／g（淀粉）、液化時間為50 min、液化溫度為90℃、液化pH 6.2。該條件下反應24 h，IG2＋P＋IG3的預測值為103.8 mg／mL。采用上述優化工藝進行驗證試驗，為104.3 mg／mL，與預測值的相對誤差0.48%?？梢姶四Ｐ涂梢暂^好地預測IG2＋P＋IG3的量。

3　結論

在研究單因素影響IG2＋P＋IG3的基礎上，進一步采用Box－Behnken法響應面優化。響應面優化模型顯著，失擬項不顯著。優化后6個因素糖化轉苷溫度為41.9℃，糖化轉苷pH 5.45，真菌α－淀粉酶酶量為30.60 U／g（淀粉）、β－淀粉酶酶量為1.04 U／g（淀粉）、普魯蘭酶酶量為 1.10 U／g（淀粉）和α－轉移葡萄糖苷酶酶量為0.48 U／g（淀粉）。該條件下IG2＋P＋IG3為104.3mg／mL，即異麥芽糖、潘糖以及異麥芽三糖總和為0.417 2 g／g（淀粉），與預測值的相對誤差為0.48%。說明該模型具有一定的應用價值。

［1］GB／T 20881—2007低聚異麥芽糖［S］

［2］Kohmoto T，Fukui F，Takaku H，et al.Dose－response test of isomaltooligosaccharides for increasing fecal bifidobacteria［J］.Agricultural and biological chemistry，1991，55（8）：2157－2159

［3］Valette P，Pelenc V，Djouzi Z，et al.Bioavailability of new synthesised glucooligosaccharides in the intestinal tract of gnotobiotic rats［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1993，62（2）：121－127

［4］趙晉，王嬌，闞健全.低聚異麥芽糖生理功能及應用的研究進展［J］.食品研究與開發，2007，28（2）：166－170

［5］王良東.低聚異麥芽糖性質、功能、生產和應用［J］.糧食與油脂，2008（4）：43－47

［6］張齊軍，覃蘭芳，陶靜，等.木薯淀粉生產異麥芽低聚糖粉的工藝研究［J］.廣西輕工業，2000（2）：5－7

［7］闞翠姝，白玉玲.不同品種淀粉特性的研究與應用［J］.現代面粉工業，2009，23（4）：41－45

［8］陳玲，溫其標，葉建東.木薯淀粉微細化及顆粒形貌的研究［J］.糧食與飼料工業，1999（12）：41－43

［9］鄒耀洪，孫佳.低聚異麥芽糖制備工藝研究［J］.常熟高專學報，2003，17（2）：41－46.