高效液相色譜質譜聯用儀分析不同產地蜂膠的多酚類成分

羅照明 張紅城

（中國農業科學院蜜蜂研究所，北京100093）

高效液相色譜質譜聯用儀分析不同產地蜂膠的多酚類成分

羅照明 張紅城

（中國農業科學院蜜蜂研究所，北京100093）

建立了蜂膠中的酚酸和黃酮的高效液相色譜質譜聯用（HPLC-MS）定量方法。不同來源的蜂膠樣品置于乙醇中，在70℃的條件下提取2h，提取物通過5μmC18對稱性的250 mm×4.6 mm柱子分離。通過線性梯度洗脫方法分離，二極管陣列檢測器（DAD）設置在200~450 nm，MS測定范圍設在100~1000 Da。其中的大部分化合物主要是通過與標準品的HPLC色譜圖的保留時間（RT）和紫外光譜對照進行定性的。沒有標準品的，通過色譜的在線的紫外數據和質譜進行確認。歐洲、中國和阿根廷蜂膠的主要特點是含有黃酮和酚酸，主要成分為柯因（2~4%），松屬素（2~4%），短葉松素乙酸酯（1.6~3%）及高良姜素（1~2%）。巴西蜂膠主要含有阿替匹林C、咖啡酰奎尼酸和黃酮類物質。如果考慮將黃酮的總含量納入質量標準，我們認為低于11%的黃酮含量的蜂膠是次品，黃酮含量在11~ 14%為可以接受的，黃酮含量在14~17%的屬于質量好的，高于17%屬于高質量的。LC－DAD－MS分析方法可以用于蜂膠的化學成分的分析和商業上的蜂膠制品的質量鑒定。

蜂膠；多酚；LC－DAD－MS

1 引言

蜂膠是蜜蜂從植物幼芽與樹干裂縫處采集的樹膠與其上顎腺分泌物（如β-糖苷酶）和蜂蠟等混合加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物。蜜蜂用蜂膠來堵塞蜂箱的縫隙，維持蜂箱的溫度，阻止外來生物的侵入，而且抑制內部微生物的生長，并將大型的入侵者包裹以防止其腐敗。蜂膠是一種傳統的用于治療各種疾病的民間藥材，大量的研究表明，蜂膠有抑制細菌真菌生長、抗病毒、抗炎、局部麻醉、抗氧化、免疫刺激、止齲、抗癌等生物活性。

蜂膠包含不同種類的化學成分，包括酚酸及其酯類、黃酮類（黃酮、黃烷酮、黃酮醇、二氫黃酮、查爾酮）、萜烯類、芳香醛、芳香醇、脂肪酸、二苯乙烯和β-類固醇。蜂膠不能直接使用，需要提取純化來除去惰性成分并保護多酚類成分。事實上，和其他成分相比，蜂膠里多酚類成分被認為是具有治療作用的生物活性成分。因此，此類物質被廣泛的研究，也建立了很多有效的分析方法。本文主要目的是研究不同地區采集的蜂膠樣品的質量。為了這個目的，建立了蜂膠樣品中黃酮和酚酸定性及定量的LC－DAD－MS分析方法。通過分子離子峰（MS）和相應的離子碎片（MS/MS）對不同的化合物進行確認。

2 材料和方法

2.1 化學藥品

柯因（C），高良姜素（G），松屬素（P），槲皮素（Q），山奈酚（K），異鼠李素（I），櫻花素（S），異櫻花素（iS）,芹菜素（A），刺槐素（Ac），5,7-二甲氧基松屬素（P-DME）和7-甲氧基柯因（C-7ME）購買于里昂諾德公司（Genay，France）。咖啡酸苯乙酯（CAPE），咖啡酸（CA），P-香豆酸（pC），阿魏酸（FA），肉桂酸（CiA），異阿魏酸（iFA）和3,4-二甲基咖啡酸（DMCA）購買于Sigma公司。水由MilliQ設備制備。蜂膠樣品由Specchiasol s.r. l贈送。

2.2 蜂膠樣品

蜂膠樣品于最近5年從中國（12），韓國（1），阿根廷（25），巴西（9），智利（7），烏拉圭（4），巴拉圭（1），法國（6），波蘭（12），德國（1），馬其頓（4），俄羅斯（1），克羅地亞（12），意大利（9），保加利亞（1），加拿大（2）購買，并儲存在－20℃溫度下。

2.3 樣品準備

取冷凍的蜂膠樣品200 g，用磨粉機將其充分粉碎，稱量5g于70mL乙醇中，置于70℃的溫度下2h，然后冷卻，過濾，固體殘渣用同樣體積的乙醇提取兩次。然后將3次（每次70mL）的提取液準確定容至100 mL，過0.22μm的膜，用甲醇稀釋50倍，10μL注入HPLC系統中。

2.4 LC-DAD-MS分析

色譜系統是配備有二極管陣列檢測器2996、三倍的四級桿質譜分析器的Alliance 2695。分離的色譜柱為5μmC18對稱性的250 mm×4.6 mm柱子，流速設置為1.2 mL/min，柱溫維持在30℃，分流的比例為5:1。分離方法為線性梯度洗脫（洗脫程序如下：20%B 6 min，在4min內20~30%B，在30min內30~40%B，在20min內40~60%B，在20min內60~90%B，10min內90%B。色譜數據的紫外檢測范圍在200~450 nm，檢測波長290nm。質譜設置為陰離子和陽離子下模式，范圍在100~1000 Da。毛細管出口電壓3.0 kV，孔電壓在20V，離子源的溫度為130℃，解離的溫度350℃。數據通過具有對離子碎片分析的Quan-Optimize選項的Masslinx 4.0軟件(Micromass)獲得。每一個酚酸和黃酮的標準品的母液為20mg溶于20mL的甲醇中，然后稀釋進入色譜系統獲得標準曲線，標準曲線的范圍在2~ 50μg/mL。

2.5 方法驗證

LC-DAD-MS方法是經過線性、量化及檢測、準確度、峰純度和重復性驗證過。量化的限定值（S/N的比率為6）和檢測限（S/N的比率為3），通過標準溶液的稀釋獲得。準確度通過包含有CA，pC，FA，iFA，DMCA，CiA，CAPE，Q，C，P，G，C-7ME和P-DME標準品的混合物，分別以三種含量（2，10，20 mg）加入到5g的蜂膠標準品進樣進行評價。加入標準品的蜂膠在最佳的條件下提取，然后通過黃酮和酚酸評價回收率。峰的純度和確認由LC-DAD-MS和LC-MS/MS進行分析。通過連續5天分析蜂膠樣品來驗證實驗的精度。通過評價標準品保留時間的差異來驗證重復性。

3 結果與討論

3.1 樣品準備

通過不同蜂膠樣品出現過的黃酮和酚酸，來混合標準品。第一組和第二組的提取率分別為92.8±2.1%和7.2±2.1%，第三組的黃酮和酚酸沒有檢測。

3.2 方法驗證

每一個標準品以5個濃度梯度來繪制標準曲線，3次獨立地測定每一種濃度。標準曲線的線性關系用回歸方法分析，標準曲線的方程如表1。加入標準品的蜂膠的黃酮和酚酸的提取的準確度分別為98.2±3.1%和97±2.4%。通過一天之中5次和連續5天的再現性考察實驗儀器的精密度，變異系數低于5.4%。量化限（LOQ）和檢測限（LOD）分別為2和0.8μg/mL。關于重復性，在三次的進樣中，最大的相對標準偏差為2%（柯因，松屬素和高良姜素）。

表1 蜂膠提取物中不同多酚的標準品的線性回歸方程（Y=mX+q）a

圖1 不同地區來源蜂膠樣品中發現的黃酮、酚酸及其酯類的結構

圖2 南美洲（A：阿根廷，B：巴西）和歐洲（C：意大利）蜂膠醇提物的290nm處的HPLC色譜圖。峰名稱及結構見圖1。

圖3 短葉松素-5-甲氧基乙酯（MW328，峰18）在低碰撞能量（10ev）下的斷裂模式。離子碎片[m/z]-59就是乙酯部分。

圖4 短葉松素-3-丙酸酯（MW328，峰35）解離模式

3.3 LC-DAD-MS和LC-MS/MS分析

蜂膠中的多酚的成分主要是一些肉桂酸的衍生物和黃酮，它們的結構如圖1所示。這些成分非常復雜，其成分的確認需要HPLC結合在線的紫外檢測器及MS/MS方法。另外，也有可能出現錯誤的鑒別，這種情況在一篇基于LC-ESI-MS方法的文獻中報道柚皮素的存在。我們的研究表明，柚皮素在蜂膠中不存在，可能的原因是引用的文獻提到的，而且易與短葉松素混淆。柚皮素和短葉松素有相同的分子量、紫外光譜及相似的保留時間。因此，LC-DAD-ESI-MS方法仍是不充分的，LC聯合在線的MS/MS檢測方法仍需要仔細辨別這些成分。事實上，結合MS分析柚皮素的離子碎片[m/ z]-151，而短葉松素產生的典型的離子碎片有[m/z]-253。

（未完待續）

羅照明（1986－），碩士研究生，研究方向為食品科學。

張紅城，E-mail：zzhc@sohu.com