米糠多糖和大豆多糖的結(jié)構(gòu)特征及免疫調(diào)節(jié)活性比較

易 陽 張名位 魏振承 黃 菲

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所1，廣州 510610）

（武漢工業(yè)學院食品科學與工程學院2，武漢 430023）

稻谷和大豆是極其重要的糧油資源。2010年，我國稻谷產(chǎn)量接近2億噸，而以大豆為主的豆類產(chǎn)量也有近0.2億噸［1］。米糠和豆粕分別是稻谷和大豆加工的主要副產(chǎn)物，目前絕大部分作為動物飼料原料被廉價消耗掉。為提高米糠和豆粕的經(jīng)濟附加值，其功能活性成分，特別是多糖的生物活性評價及開發(fā)利用受到廣泛關(guān)注。多糖能有效調(diào)節(jié)機體免疫功能，且不會產(chǎn)生（顯著的）毒副作用。香菇多糖、云芝多糖和裂褶菌多糖等，作為理想的免疫佐劑在臨床應用上表現(xiàn)突出［2］。而灌胃一定劑量的米糠多糖或大豆多糖均能明顯提升正常小鼠免疫系統(tǒng)功能，對淋巴細胞增殖和巨噬細胞吞噬功能有顯著的增強作用［3－5］。但其能否直接刺激細胞免疫應答，以及是否作用于相同的效應細胞，尚鮮見報道。多糖主要通過細胞表面受體與淋巴細胞和巨噬細胞結(jié)合，進而觸發(fā)一系列的免疫應答反應，其構(gòu)效關(guān)系的本質(zhì)在于多糖結(jié)構(gòu)與受體親和力的強弱［6－7］。多糖的結(jié)構(gòu)復雜且多樣，不同結(jié)構(gòu)對免疫細胞受體的親和力不同導致其活性有所差異，而關(guān)于米糠多糖和大豆多糖的免疫調(diào)節(jié)活性強弱尚未可知。鑒于此，本研究采用熱水法從米糠和豆粕中提取分離粗多糖，分析比較其結(jié)構(gòu)特性及體外對淋巴細胞和巨噬細胞的免疫刺激作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試驗動物和細胞

脫脂米糠、豆粕：廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所糧油加工與功能食品實驗室；RAW264.7細胞：中山大學實驗動物中心，由本實驗室繼代培養(yǎng)；體重（20±2）g的BALB／C雄性小鼠：南方醫(yī)科大學實驗動物中心，在9～10周齡時進行試驗。

1.2 試劑及儀器

RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清：美國Gibco公司；甲基噻唑基四唑（MTT）、刀豆球蛋白A（ConA）和脂多糖（LPS）：美國 Sigma公司；考馬斯亮藍試劑盒：南京建成生物工程研究所。

SBS－Z100數(shù)控計滴自動部分收集器、L－2恒流泵：上海青浦瀘西儀器廠；Nexus 5DXC紅外分光光譜儀、MK3酶標儀：美國賽默飛世爾公司；MCO－175水套式 CO2培養(yǎng)箱：日本三洋公司；Agilent 6890－5973氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司；L－8900氨基酸自動分析儀：日本日立公司。

1.3 米糠多糖和大豆多糖的制備

米糠多糖和大豆多糖的提取方法參考文獻［8］，略有修改。50 g原料加入500 mL蒸餾水，在80℃水浴下恒溫攪拌浸提4 h。4 500 r／min離心10 min分離上清液（米糠上清液需采用酶法除去可溶性淀粉），過濾分離提取液。采用Sevag法去除蛋白后，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮提取液。將濃縮液轉(zhuǎn)入透析袋（分子截留量8 000）中，在大量4℃蒸餾水中透析72 h。4 500 r／min離心10 min分離透析清液，濃縮并冷凍干燥為多糖樣品。米糠多糖（RBP）和大豆多糖（SBP）的得率分別為1.24%和1.09%。

1.4 化學組成測定

多糖含量采用苯酚硫酸法［9］測定；蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍試劑盒測定；單糖組成參考文獻［10］采用GC－MS測定；氨基酸組成參考文獻［11］采用氨基酸自動分析儀測定。

1.5 相對分子質(zhì)量分布分析

相對分子質(zhì)量分布參考文獻［12］采用Sephadex G－100凝膠過濾法測定。

1.6 光譜特征掃描

多糖的紅外和紫外光譜特征參考文獻［10］測定。

1.7 脾淋巴細胞增殖測定

小鼠經(jīng)摘眼球放血處死后，按實驗室常規(guī)制備單個脾細胞懸液。以含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×107cells／mL，50 μL／孔加入96孔板中。多糖經(jīng)完全培養(yǎng)液溶解并過濾除菌后，以40μL／孔 加入細胞孔內(nèi)，隨后每孔加入10μL培養(yǎng)液、50μg／mL ConA或50μg／mL LPS（多糖終濃度分別為0、50、100、200或 400μg／mL）。各試驗組均設(shè)6個復孔，另設(shè)100μL培養(yǎng)液孔用于調(diào)零。將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h，每孔加入5 mg／mL的 MTT 20μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入100μL酸性異丙醇，放置過夜。于570 nm下用酶標儀測各孔吸光值（A）。淋巴細胞增殖刺激指數(shù) SI＝（A刺激組－A空白組）／A空白組×100%。

1.8 巨噬細胞吞噬功能和NO生成測定

RAW264.7巨噬細胞經(jīng)DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為5×105cells／mL，以100μL／孔 加入96孔板中，于培養(yǎng)箱中孵育3 h后，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去未貼壁細胞。多糖由完全培養(yǎng)液溶解并過濾除菌后，以100μL／孔 加入96孔板，終濃度為0、50、100、200或 400μg／mL，各濃度均設(shè)6個復孔。另設(shè)5μg／mL LPS刺激孔作為陽性對照。細胞培養(yǎng)24 h后，吸除上清液，以 PBS洗滌2遍，每孔加入0.1%中性紅的PBS溶液100μL，并繼續(xù)培養(yǎng)4 h。再棄去上清液，并用PBS洗滌3遍，每孔加入細胞裂解液100μL，4℃下放置過夜。于570 nm下用酶標儀測各孔A值。吞噬指數(shù) PI＝（A刺激組－A空白組）／A空白組×100%。

5×105cells／mL的RAW264.7巨噬細胞以500 μL／孔加入24孔板中，于培養(yǎng)箱中孵育3 h后，由PBS洗去未貼壁細胞。多糖以500μL／孔加入24孔板，終濃度為0、50、100、200或400μg／mL，各濃度均設(shè)6個復孔。另設(shè)5μg／mL LPS刺激孔作為對照。細胞培養(yǎng)24 h后，每孔分別取150μL細胞液于1.5 mL離心管中，加入300 g／L的 ZnSO4溶液 10μL，混勻沉淀蛋白。每孔平行取樣3次。4 500 r／min離心10 min后，取100μL上清液于96孔培養(yǎng)板中，加入等體積的Griess試劑，室溫下輕輕搖振10 min，并于酶標儀上測定492 nm處A值。通過NaNO2建立的標準曲線計算細胞液中 NO濃度（c，μmol／mL）。NO生成指數(shù) NI＝（c刺激組－c空白組）／c空白組×100%。

1.9 統(tǒng)計分析

采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，并以S－N－K檢驗比較各組間差異，顯著性水平為P＜0.05，以不同小寫字母標示。數(shù)據(jù)以ˉ±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 RBP和SBP的化學組成

由表1可見，RBP和SBP的多糖及蛋白含量存在極為明顯的差異，其多糖與蛋白的質(zhì)量比值分別為7.71和1.90。多糖部分，RBP主要由葡萄糖和甘露糖以物質(zhì)的量比4.27∶1.00組成，而SBP主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖以物質(zhì)的量比5.55∶3.49∶1.00組成。蛋白質(zhì)部分，RBP中檢測出17種氨基酸，而SBP中含有15種且未檢測出天冬氨酸和絲氨酸，兩者的氨基酸組成中均以谷氨酸含量最高（表1）。

表1 多糖RBP和SBP的化學組成

2.2 RBP和SBP的相對分子質(zhì)量分布

多糖分子通過凝膠柱時，各級分根據(jù)相對分子質(zhì)量大小實現(xiàn)分離。由圖1可見，RBP的相對分子質(zhì)量分布較SBP分散。RBP在洗脫體積10～35 mL內(nèi)出現(xiàn)4個疊加的多糖峰，且以相對分子質(zhì)量較低級分（峰值31 mL）的含量最高。同時，該級分的多糖峰與蛋白峰響應一致，推斷為蛋白多糖。SBP僅呈現(xiàn)唯一的多糖峰，且同在峰值30 mL處出現(xiàn)蛋白峰，說明含有少量結(jié)合蛋白。由此可見，RBP和SBP的主要組成級分為蛋白多糖。

圖1 多糖RBP和SBP的Sephadex G－100凝膠過濾色譜圖

2.3 RBP和SBP的光譜特征

由紫外光譜圖可見（圖2），RBP和SBP分別在262和258 nm處出現(xiàn)明顯的蛋白吸收峰。紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)RBP和SBP都具有多糖和蛋白的特征吸收（圖3），包括：3 398.2和 3 402.6 cm－1處羥基 O—H的伸縮振動吸收峰；2 930.8和2 933.4 cm－1處氨基C—H的伸縮振動吸收峰；1 654.9和1 654.1 cm－1處羰基C═O的伸縮振動吸收峰；1 541.5和1 558.5 cm－1處氨基N—H的彎曲振動吸收峰；1 419.9和1 405.9 cm－1處羧基C—O的伸縮振動吸收峰；以及1 024.3和1 050.9 cm－1處羥基O—H的彎曲振動吸收峰。930.1和925.8cm－1處的反對稱環(huán)振動吸收峰說明RBP和SBP均含有D吡喃葡萄糖，而849.9和831.5 cm－1處吸收峰說明其均含有α型糖苷鍵。

圖2 多糖RBP和SBP的紫外光譜圖

圖3 多糖RBP和SBP的紅外光譜圖

2.4 RBP和SBP對脾淋巴細胞增殖的影響

由圖4可見，RBP和SBP在50μg／mL劑量下促進正常淋巴細胞增殖，但隨劑量增加表現(xiàn)出明顯的抑制作用。相比 ConA對照組，二者在50～400 μg／mL劑量范圍內(nèi)均顯著刺激ConA誘導的淋巴細胞增殖（P＜0.05），且以400μg／mL劑量的 SI值較高。相同劑量下，RBP和SBP對正?；駽onA誘導的脾淋巴細胞增殖的SI值無顯著差異（P＞0.05）。相比LPS對照組，50μg／mL的RBP和SBP均能顯著刺激LPS誘導的細胞增殖（P＜0.05），且兩者無顯著差異（P＞0.05），而其高劑量都未表現(xiàn)出刺激作用。相反，200和400μg／mL的 SBP顯著抑制 LPS誘導的增殖作用（P＜0.05）。

圖4 多糖RBP和SBP對脾淋巴細胞增殖的影響

2.5 RBP和SBP對巨噬細胞吞噬功能及NO生成的影響

由圖5可見，RBP和 SBP在50～400μg／mL劑量范圍內(nèi)均能不同程度增強巨噬細胞的吞噬功能，且PI值與5μg／mL劑量LPS的作用相當或更高。RBP和SBP在200μg／mL劑量下的PI值均顯著高于其他劑量（P＜0.05）。在100～400μg／mL范圍的相同劑量下，RBP的PI值明顯高于SBP（P＜0.05）。

圖5 多糖RBP和SBP對巨噬細胞吞噬功能的影響

圖6 多糖RBP和SBP對巨噬細胞NO生產(chǎn)的影響

由圖6可見，RBP在50～400μg／mL的劑量范圍明顯抑制巨噬細胞NO生成，而SBP卻能不同程度刺激巨噬細胞NO生成。但SBP作用下的NI值隨劑量的增加顯著降低（P＜0.05），其中僅50μg／mL劑量的刺激效果顯著強于5μg／mL劑量 LPS（P＜0.05）。

3 討論

分析60%乙醇沉淀的米糠粗多糖的組成發(fā)現(xiàn)，其中相對分子質(zhì)量較小級分的蛋白質(zhì)含量最高，而相對分子質(zhì)量較高級分的含量（48.1%）最高，且其主要亞級分由阿拉伯糖、半乳糖、木糖和葡萄糖組成［13］。通過熱提－極性pH值法提取得到的大豆粗多糖主要由含有9.2%結(jié)合蛋白的級分SSPS－1和蛋白質(zhì)量分數(shù)86.7%的糖蛋白SSPS－2組成（與圖1中凝膠色譜分析較一致），而SSPS－1主要由鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖組成［14］。本研究分離得到的RBP和SBP的蛋白質(zhì)含量、單糖組成以及相對分子質(zhì)量分布均與已有文獻存在較大差異，可能源于原料品種、提取方法以及純化程度的不同。β－消去反應過程中，絲氨酸和蘇氨酸與單糖形成的O型糖苷鍵在弱堿條件下生成α－氨基丙烯酸和α－氨基丁酸，并導致240 nm處吸收增加［15］，由此證實RBP和SBP中均存在O型糖苷鍵（圖2）。結(jié)合化學組成和光譜分析，可以推斷RBP和SBP為主要由α－D－葡萄糖組成的蛋白多糖。

ConA和LPS誘導的淋巴細胞增殖體系常分別用于評價多糖對T細胞和B細胞的刺激活性［16－17］。RBP和SBP都只在低劑量（50μg／mL）下刺激正常和LPS誘導的淋巴細胞增殖，且隨劑量增加表現(xiàn)出明顯的抑制作用，但兩者在50～400μg／mL范圍內(nèi)隨劑量增加顯著促進ConA誘導的增殖（圖4），說明RBP和SBP可能選擇性刺激T細胞。研究枸杞多糖發(fā)現(xiàn)，蛋白含量相對高的LBP、LBPF4和LBPF5選擇性刺激T細胞活化，但蛋白含量相對少的LBPF1、LBPF2和LBPF3卻未表現(xiàn)出刺激作用，且LBP、LBPF4和LBPF5經(jīng)蛋白酶酶解后對脾淋巴細胞增殖的刺激作用顯著降低［18］。相反，刺五加多糖選擇性刺激B細胞，而經(jīng)蛋白酶消化結(jié)合蛋白后，多糖對脾淋巴細胞增殖的促進作用并未減弱［19］。由此推測，RBP、SBP及枸杞多糖的結(jié)合蛋白可能對T細胞激活有重要作用。此外，RBP和SBP還能顯著增強巨噬細胞吞噬功能，但RBP明顯抑制其NO生成，而SBP卻隨劑量減小逐漸增加其NO生成（圖4和圖5）。分析其原因可能是：RBP刺激巨噬細胞的M2極化，促進Th2應答，NO生成減少；而SBP刺激巨噬細胞M1極化，促進Th1應答，增加包括NO在內(nèi)的炎癥介質(zhì)表達［16］。RBP和SBP均在體外表現(xiàn)出良好的脾淋巴細胞和巨噬細胞激活功能，其作用甚至強于5 μg／mL的ConA或LPS，作為免疫佐劑具有良好的開發(fā)應用前景。

4 結(jié)論

從米糠和豆粕中分離得到的粗多糖RBP和SBP均為組成復雜的蛋白多糖，其結(jié)構(gòu)特征明顯不同，差異主要涉及結(jié)合蛋白含量、單糖和氨基酸組成以及相對分子質(zhì)量分布。在50～400μg／mL劑量范圍內(nèi)，RBP與SBP對小鼠脾淋巴細胞增殖的刺激作用相當，且效應細胞一致。RBP對巨噬細胞吞噬功能的增強作用要略強于SBP，而兩者對其NO生成則發(fā)揮相反的作用。RBP和SBP在免疫調(diào)節(jié)活性上的異同與其結(jié)構(gòu)特征密切關(guān)聯(lián)，還需結(jié)合多糖的一級和高級結(jié)構(gòu)特征以及多糖的作用受體類型進一步深入闡釋。

［1］中華人民共和國國家統(tǒng)計局.2011中國統(tǒng)計年鑒［M／CD］.北京：中國統(tǒng)計出版社，2011［2012－11－06］.http：／／www.stats.gov.cn／tjsj／ndsj／2011／indexch.htm

［2］Leung M Y K，Liu C，Koon J C M，et al.Polysaccharide biological response modifiers［J］.Immunology Letters，2006，105（2）：101－114

［3］丘玉昌，吳曙光，徐偉.米糠多糖的提取及免疫調(diào)節(jié)作用［J］.中國生化藥物雜志，1999，20（2）：91－93

［4］姜元榮，姚惠源，陳正行，等.堿溶性米糠多糖的提取及其免疫調(diào)節(jié)功能研究［J］.中國糧油學報，2004，19（6）：3－7

［5］張倩.可溶性大豆多糖的提取、鑒定及生物活性的研究［D］.合肥：合肥工業(yè)大學，2007

［6］易陽，曹銀，張名位.多糖調(diào)控T／B淋巴細胞免疫應答機制的研究進展［J］.中國細胞生物學學報，2012，34（1）：67－74

［7］易陽，曹銀，張名位.多糖調(diào)控巨噬細胞免疫應答機制的研究進展［J］.中國細胞生物學學報，2011，33（11）：1267－1277

［8］張銘，傅承新.米糠多糖提取工藝的優(yōu)化［J］.中國糧油學報，2001，16（5）：11－13

［9］Dubois M，Gilles K A，Hamilton JK，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］.Analytical Chemistry，1956，28：350－356

［10］Yi Y，Zhang M W，Liao S T，et al.Structural features and immunomodulatory activities of polysaccharides of longan pulp［J］.Carbohydrate Polymers，2012，87（1）：636－643

［11］GB／T 5009.124—2003食品中氨基酸的測定［S］

［12］Yi Y，Liao S T，Zhang M W，et al.Physicochemical characteristics and immunomodulatory activities of three polysaccharide－protein complexes of longan pulp［J］.Molecules，2011，16（7）：6148－6164

［13］姜元榮.米糠免疫活性多糖的研究［D］.無錫：江南大學，2004

［14］章文琴.動態(tài)高壓微射流技術(shù)對大豆多糖組分、結(jié)構(gòu)及功能特性的影響［D］.南昌：南昌大學，2010

［15］朱彩平.枸杞多糖的結(jié)構(gòu)分析與生物活性評價［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2006

［16］Zhang CX，Huang K X.Characteristic immunostimulation by MAP，a polysaccharide isolated from the mucus of the loach，Misgurnus anguillicaudatus［J］.Carbohydrate Polymers，2005，59（1）：75－82

［17］Zhao C，Li M，Luo Y F，et al.Isolation and structural characterization of an immunostimulating polysaccharide from fuzi，Aconitum carmichaeli［J］.Carbohydrate Research，2006，341（4）：485－491

［18］Chen Z S，Tan B K H，Chan S H.Activation of T lymphocytes by polysaccharide－protein complex fromLycium barbarum L［J］.International Immunopharmacology，2008，8（12）：1663－1671

［19］Han SB，Park SK，Ahn H J，et al.Characterization of B cell membrane receptors of polysaccharide isolated from the root of Acanthopanax koreanum ［J］.International Immunopharmacology，2003，3（5）：683－691.